HPLC法測定天山雪蓮提取物固體脂質納米粒載藥量與包封率

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　　【摘 要】 目的：建立HPLC法同時測定天山雪蓮提取物固體脂質納米粒中綠原酸和蘆丁的載藥量和包封率的方法。方法：采用Shim-pack VP-ODS C18 （4.6mm×250mm，5μm）;流動相：乙腈（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脫，體積流量1.0mL/min;檢測波長分別為327nm、257nm，柱溫35℃。采用超濾法分離天山雪蓮提取物固體脂質納米粒與游離藥物測定包封率。結果：綠原酸和蘆丁分離度良好，質量濃度分別在9.625～96.25μg/mL、12.87～128.7μg/mL范圍內與色譜峰面積均呈良好的線性關系，平均加樣回收率分別為（98.5±0.12）% 和（99.40±0.21）%，精密度和穩定性較好。超濾法回收率分別為（99.31±0.97）%和（99.44±0.36）%。2種成分的重復性實驗的RSD均小于2.0%。3批天山雪蓮提取物固體脂質納米粒中綠原酸和蘆丁的包封率分別為（83.82±0.32）%和（87.78±0.80）%，載藥量分別為（17.66±0.40）%和（20.14±0.33）%。結論：本法簡單快速、結果準確可靠，可同時測定天山雪蓮提取物固體脂質納米粒中綠原酸和蘆丁的載藥量和包封率。
　　【關鍵詞】 天山雪蓮;固體脂質納米粒;載藥量;包封率
　　【中圖分類號】R284.2 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）4-0029-05
　　Abstract：Objective To establish a method for simultaneous determination of drug loading and entrapment efficiency of chologenic acid and rutin from Saussureae Involucratae Herba  extract（SIHE）- solid lipid nanoparticles（SLN）. Methods The determination was carried out over Shim-pack VP-ODS column （250mm×4.6mm， 5μm） at the column temperature （35℃）. The mobile phase consisted of acetonitrile （A）-0.4% ortho-phosphoric acid （B） solution with the gradient elution， the flow rate was 1.0 mL·min-1 and detection wavelength was set at 327 nm and 257 nm. The free drugs in Saussureae Involucratae Herba  extract（SIHE）- solid lipid nanoparticles（SLN） were separated by ultrafiltration. Results Chologenic acid and rutin had a good linear relation within the concentration ranges from 9.625～96.25μg/mL，12.87～128.7μg/mL. The average recoveries were （98.5±0.12）% and（99.40±0.21）%.Results of stability and precision were good.The average recoveries of ultrafiltration were （99.31±0.97）% and（99.44±0.36）%， respectively and the RSD values of reproducibility tests for the two analytes were less than 2.0%. The entrapment efficiency and drug loading in SIHE-SLN were （83.82±0.32）% and （17.66±0.40）% for chologenic acid， （87.78±0.80）% and （20.14±0.33）% for rutin. Conclusion The method is accurate， simple， sensitive and applicable for determination of drug loading and entrapment efficiency of SIHE-SLN.
　　Keywords：Saussureae Involucratae Herba  Extract; Solid Lipid Nanoparticles; Drug Loading; Entrapment Efficiency
　　天山雪蓮為菊科植物天山雪蓮Saussurea involucrata（Kar. et Kir.）Sch.–Bip. 的干燥地上部分，始見于藏藥文獻《月王藥珍》，清代《本草綱目拾遺》中也有記載，維吾爾名為“塔格依力斯”，系維吾爾醫習用藥材。天山雪蓮在醫藥應用已有數百年的歷史，全草入藥，具有補腎活血，祛風勝濕、強筋健骨，營養神經，調節異常體液等作用，用于風濕性關節炎、關節疼痛、肺寒咳嗽等癥[1-3]。課題組前期研究已證實天山雪蓮提取物（Saussureae Involucratae Herba  extract， SIHE）中主要活性成分為綠原酸和蘆丁[4-5]。但SIHE的脂溶性不高、口服吸收差，生物利用度低，從而影響藥物的臨床療效。針對SIHE的這些問題，課題組開展了許多新劑型如分散片、緩釋片、微乳、磷脂復合物等的研究[6-9]，旨在提高其生物利用度，但結果尚不盡人意。固體脂質納米粒（Solid lipid nanoparticles， SLN）既具備聚合物納米粒物理穩定性高、藥物泄露少的優點，又兼具脂質體、乳劑毒性低、能大規模生產的優點，是一種極具發展前景的新型給藥載體系統，日益受到各國研究研究者的重視[10-11]。SLN可增強與生物膜的粘附性，延長胃腸道的粘附時間和滯留時間，有效地提高藥物生物利用度。采用固體脂質納米粒技術研究天山雪蓮提取物新劑型，以期提高其溶解性、穩定性和生物利用度[12]。 　　包封率和載藥量測定是制備固體脂質納米粒過程中處方工藝篩選與質量評價的重要指標和處方前研究工作。因此，實驗建立了HPLC法同時測定天山雪蓮提取物固體脂質納米粒中2種有效成分的方法，為該制劑的處方工藝研究奠定基礎。
　　1 儀器與材料
　　1.1 儀器 日本島津SPD-10AVP型高效液相色譜儀，AB135-S梅特勒-托利多電子天平（瑞士），BS110S型Sartorius電子天平（北京賽多利斯天平有限公司），JA-2003B電子天平（上海越平科學儀器有限公司），NS1001L Panda2K型高壓勻質機（意大利Niro Soavi），R-201D旋轉蒸發器（鞏義市予華儀器有限責任公司），DZKW-S-A型電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫療儀器廠），5415R離心機（德國Eppendorf），WP-UP-IV-10型Water Purifier實驗室專用超純水機（四川沃特爾科技發展有限公司）;KQ-100DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Millipore超濾離心管（Microcon YM-10，MWCO為10KDa，USA）。
　　1.2 樣品與試劑 蘆丁對照品（批號：100080-201409）、綠原酸對照品（批號：110753-201415）購自中國食品藥品檢定研究院;單硬脂酸甘油酯（批號：F20151002，中國醫藥集團上海化學試劑公司）;卵磷脂（批號：F20160322，上海國藥集團化學試劑有限公司）;山崳酸甘油酯（批號：3545PPD，Compritol 888 ATO）;吐溫-80（批號：F20161110，上海國藥集團化學試劑有限公司）;乙腈（色譜純，Fisher）;甲醇（批號：20161015，天津市福晨化學試劑廠），天山雪蓮提取物固體脂質納米粒（SIHE-SLN，自制，批號：20170315-1，20170315-2，20170315-3）。
　　2 方法與結果
　　2.1 天山雪蓮提取物固體脂質納米粒的制備 采用高壓勻質法（homogenization technique）制備天山雪蓮提取物固體脂質納米粒。稱取處方量的山崳酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、SIHE、在（80±2）℃水浴下溶于適量無水乙醇中，揮除溶劑，形成均勻的油相。取一定量的吐溫-80分散于水中，形成均勻的水相，將油相與水相攪拌混合均勻，加入高壓勻質機中進行兩次勻質乳化（10000r/min），冰浴迅速冷卻，即得SIHE-SLN。
　　2.2 包封率及載藥量的HPLC測定方法研究
　　2.2.1 供試品溶液的制備 精密量取3.0mLSIHE-SLN，置于10mL量瓶中，加入甲醇于60℃水浴破壞10min，用甲醇稀釋至刻度，過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。
　　2.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸對照品和蘆丁對照品19.25mg、25.74mg置于100mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得含綠原酸和蘆丁質量濃度分別為192.5μg/mL和257.4μg/mL的混合對照品儲備液。
　　2.2.3 色譜條件 采用Shim-pack VP-ODS C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脫（0～15min， A-B=13∶[KG-*3/5]87; 16～40min，A-B=15∶[KG-*3/5]85）;雙波長檢測：257nm（檢測蘆?。?，327nm（檢測綠原酸）;流速為1mL/min;柱溫為35℃;進樣量為10μL。
　　2.2.4 專屬性試驗 精密量取空白固體脂質納米粒及含藥固體脂質納米粒各3mL，置于10mL量瓶中，加入甲醇于60℃水浴破壞10min，用甲醇稀釋至刻度，離心，取上清液過濾。精密吸取混合對照品儲備液2mL至10mL量瓶中，加甲醇至刻度。按上述色譜條件進樣，結果見圖1。樣品色譜中與對照品色譜相同保留時間處有色譜峰，而陰性樣品無相應峰，說明樣品中其他成分對綠原酸和蘆丁這2個成分的測定無干擾，且2個成分與相鄰峰的分離度均大于1.5。
　　2.2.5 標準曲線的繪制 精密量取“2.2.2”項下混合對照品儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分別置于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列對照品溶液。精密吸取對照品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進行測定，以對照品質量濃度X（μg·mL-1）對其峰面積Y進行線性回歸，得回歸方程。見表1。
　　2.2.6 穩定性考察精密 量取3.0mL SIHE-SLN，置于10mL量瓶中，按照“2.2.1”項下方法，制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24h測定。結果表明綠原酸和蘆丁在24h內的RSD分別為1.24%、0.95%，說明供試品溶液在24h內穩定。
　　2.2.7 精密度試驗 精密量取混合標準品儲備液0.5、1.0、4.0mL分別置于10mL量瓶中，定容至刻度。于1d內間隔相等時間分別測定5次計算日內RSD（%）;連續測定3d，進行日間精密度測試，求日間精密度的RSD（%）。結果見表2。日內、日間精密度RSD均小于2.0%，說明日內、日間精密度良好。
　　2.2.8 重復性試驗 精密量取3.0mL SIHE-SLN，置于10mL量瓶中，共6份，按照“2.2.1”項下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，制備成供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進行測定并計算。結果綠原酸和蘆丁的含量平均值（n=6）分別為125μg/mL和173μg/mL;RSD分別為1.02%和1.14%。表明該方法重復性良好。
　　2.2.9 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的SIHE-SLN 1.5mL，置10mL量瓶，共6份，分別精密加入“2.2.2”項下混合對照品儲備液1.0mL，依照供試品溶液制備方法同法操作，按上述色譜條件測定并計算回收率，結果綠原酸和蘆丁的平均回收率分別為（98.5±0.12）%和（99.4±0.21）%，RSD分別為1.06%和1.27%。 　　2.2.10 超濾法回收率試驗 取適量處方比例的輔料與混合標準品儲備液混合，配置成高、中、低3個質量濃度溶液，取200μL置于超濾離心管中（MWCO為10kDa），離心（12000r/min）15min，吸取濾液，即得，進行測定。結果見表4。
　　2.2.11 SIHE-SLN的載藥量與包封率測定 游離天山雪蓮提取物藥量（WF）測定：精密量取SIHE-SLN混懸液，置超濾離心管中（MWCO為10kDa），離心（12000r/min）15min，吸取濾液，進行測定。
　　SIHE-SLN總藥量（WT）測定：精密量取SIHE-SLN混懸液3.0mL，置10mL量瓶中，加甲醇適量，水浴加熱至溶液澄清，放冷至室溫，用甲醇稀釋至刻度，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得。進行測定。按公式：包封率=（WT-WF）/ WT×100%和載藥量=（WT-WF）/Ws×100%（WT為SIHE-SLN總藥量，WF為游離藥物量，Ws為載體材料的總量），分別計算2種成分的包封率和載藥量。測定3批樣品，結果見表5。
　　3 討論
　　測定藥物包封率的方法主要有透析法、葡聚糖凝膠柱法、超濾法等。采用透析法雖簡單，費用低，但費時。在室溫條件下，透析95%以上的游離藥物需要多次更換透析介質，耗時24h。采用葡聚糖凝膠柱法分離天山雪蓮提取物固體脂質納米粒中的游離藥物，用蒸餾水作為洗脫劑時，對有效成分溶解能力較小，難以洗脫下來，造成游離藥物的回收率低，改用對有效成分溶解能力較大的乙醇水溶解洗脫時，雖然回收率高，但葡聚糖凝膠的結構發生破壞，逐漸塌陷。超濾法是在離心力的作用下，利用篩分原理對大分子和小分子物質進行分離。由于操作準確、簡便樣品不必進行稀釋，不存在被包封藥物泄露的問題，可有效分離游離藥物與固體脂質納米粒。因此，更適合天山雪蓮提取物固體脂質納米粒制備工藝優化時包封率的測定。
　　試驗表明該色譜方法準確可靠、簡單快速、可用于天山雪蓮提取物固體脂質納米粒中不同成分的包封率和載藥量的同時測定，為處方工藝研究奠定了良好的基礎。
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　?。ㄊ崭迦掌冢?018-12-24 編輯：劉斌）
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