超高效液相色譜法測定蘋果汁飲料中的展青霉素及其不確定度分析

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　　摘要  為了在測量數據的處理、測定結果的表達和測量結果質量評定等方面與國際接軌，根據測量不確定度評定和表示（GB/T 27418-2017），食品安全國家標準 食品中展青霉素的測定（GB 5009.185-2016）中第二法高效液相色譜法測定展青霉素含量的不確定度的測定和評定，分析了使用外標法單點定標測定樣品的不確定度計算方法和步驟，建立了高效液相色譜法測定方法的評定方式。通過對測量結果的不確定度評定，了解了測定過程中不確定度的主要來源，從而對在檢測過程中易產生不確定度的環節加以重視，確保檢驗結果的可靠性。
　　關鍵詞 超高效液相色譜;展青霉素;蘋果汁飲料;不確定度
　　中圖分類號：O657.7+2 文獻標識碼：A 文章編號：2095-3305（2019）02-008-03
　　DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2019.02.004
　　Abstract In order to be in line with international standards in the processing of measurement data， the expression of measurement results and the quality evaluation of measurement results， the uncertainty of determination of paeonillin in food safety national standard GB 5009.185-2016 by second?method high performance liquid chromatography was determined and evaluated according to the evaluation and expression of measurement uncertainty （GB/T 27418-2017）. The uncertainty of determination of paeonillin in food safety national standard GB 5009.185-2016 was analyzed. The methods and steps of calculating the uncertainty of single?point calibration of samples by external standard method were used to establish the evaluation method of high performance liquid chromatography method. By evaluating the uncertainty of measurement results， the main sources of uncertainty in the determination process were understood， and the links that easily produce uncertainty in the detection process were paid attention to， so as to ensure the reliability of the test results.
　　Key words   Ultra High Performance Liquid Chromatography;Penicillin;Apple Juice Beverage; Uncertainty
　　測量不確定度在檢測、校準和合格評定中具有重要作用。中國實驗室國家認可委員會（CNAL）要求經CNAL認可的檢測實驗室必須建立測定不確定度的評定程序，并有能力對每項數值要求的測量結果進行不確定評定 。食品檢驗工作是從最基本的稱量到通過各種復雜理化方法，最終確定某種成分含量的測量過程。測量結果會受到諸多因素的影響和限制，如儀器精度、人員技術熟練水平、操作條件等。為了客觀評價測量結果的可靠性，引入了“測量不確定度”這一概念。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　 供試樣品為市場隨機抽查的蘋果汁飲料。
　　 展青霉素標準品純度≥99.5%，1 mg;乙腈、冰乙酸為色譜純，其他試劑均為分析純。
　　1.2 儀器與設備
　　 Waters UPLC 高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器）;MycoSep228凈化柱，氮氣吹干;測定的環境條件：溫度（20±5）℃，相對濕度≤75%。
　　1.3 樣品處理
　　 參照GB 5009.185-2016 食品安全國家標準 食品中展青霉素的測定中第二法高效液相色譜法進行。
　　1.4 色譜條件
　　 色譜柱：C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流動相：乙腈+水（10∶90，體積比）;檢測波長：276 nm;流速：0.8 ml/min;柱溫：35℃，進樣量：10 μl。
　　2 結果與分析
　　2.1 數學模型
　　X=
　　 式中，X為試樣中展青霉素的殘留量（ng/g）;A為樣液中展青霉素的色譜峰面積;cs為標準工作液中展青霉素的濃度（ng/ml）;V為樣液最終定容體積（ml）;AS為標準工作液中展青霉素的色譜峰面積;m為最終樣液所代表的試樣量（g）。
　　2.2 不確定度的來源分析
　　 從測定過程和確定的數學模型分析，展青霉素含量測定的不確定度主要來源于：標準物質U（S）、標準溶液重復進樣Urel（AS）、樣品峰面積的測定Urell（A）、樣品稱量Urel（m）、定容體積Urel（V）、樣品處理操作過程Urel（P）的差異等幾個方面。 　　2.3 不確定度計算公式
　　 Urel（X）=[U（cs）/cs]2+[U（A）/A]2+[U（V）/V]2+[U（m）/m]2+[U（As）/As]2
　　 即：UC2（X）rel=UC2（cs）rel+UC2（A）rel+UC2（V）rel+UC2（m）rel+UC2（As）rel
　　2.4 不確定度的評定
　　2.4.1 標準物質的不確定度 標準物質不確定度包含標準物質、標準儲備液和標準工作液配制過程引入的不確定度。
　　 （1）標準物質引入的不確定度評定。根據標準物質證書提供的信息，展青霉素胺的不確定度為±0.5%，按正態分布考慮，包含因子k=3，屬B類評定，則有相對標準不確定度為：
　　U標物=0.5%/3=1.67×10-4。
　　 （2）標準儲備液配制過程引入的不確定度評定。標準物質有僅1 mg，用5 ml（V1）分度吸量管（A級）取乙酸乙酯溶解，其溶液為200 μg/ml。再用2 ml（V2）分度吸量管（A級）取200 μg/ml溶液吹干用乙酸水溶液定容至100 ml，濃度為4 μg/ml。最后用1 ml（V3）分度吸量管（A級）取4 μg/ml溶液吹干用乙酸水溶液定容至100 ml，濃度為40 ng/ml。
　　 該過程使用的玻璃量具，按照JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》的要求，均有相應的最大容量允差，按矩形分布考慮，k=。標準儲備液不確定度來源為：5 ml（V1）分度吸量管（A級）
　　 由5 ml A級單標移液管引起的不確定度[U（V1）]：
　　 ①校準。A級5 ml單標移液管的容量允許誤差為±0.02 ml，取k=，則U（V11）=0.02/=0.012 ml;
　　 ②重復性。A級5 ml單標移液管讀數重復性為±0.01 ml，取k=，則U（V12）=0.01/=0.006 ml;
　　 ③ 溫度。實驗室的溫度波動范圍一般為±5℃，20℃玻璃膨脹系數為2.5×10-5/℃，乙酸乙酯體積膨脹系數為1.39×10-3/℃，容量瓶校準溫度與使用溫度不同引起的體積不確定值：
　　 ΔV=V1-V2=（α-α玻璃）×V×ΔT=（1.39×10-3-2.5×10-5）×100×5=0.682 5（ml）
　　 按照矩形分布換算成標準偏差為：
　　 ΔV/k=0.682 5/=0.393 9（ ml）
　　 Urel（t）=0.393 9 ml/5 ml=0.078 78
　　 以上3項合成得出Urel（V）==0.079 87
　　 因此，標準儲備液配制過程的相對不確定度：
　　 Urel（儲備液）==0.079 87
　　 （3）標準工作液配制過程產生的不確定度評定。標準工作液是由三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋得到的質量濃度分別為40 ng/ml。標準工作液制備過程使用了一系列玻璃量具，按照JJG 196-2006的要求，均有相應的最大允差，按照矩形分布考慮，k=，相對不確定度分量見表1 。
　　 因此，標準工作液配制產生的不確定度：Urel標曲==0.006 2
　　 由上述不確定度分量，得到展青霉素標準物質的相對標準不確定度：Urell（S）==0.080 11。
　　2.5 由重復進樣引起的不確定度U（As）與U（A）
　　 由儀器給出標準溶液和樣品峰面積標準偏差為U（As）與U（A），是隨機測量，屬A類不確定度。
　　2.5.1 標液溶液重復進樣5次測定峰面積 分別為：43 125、43 598、42 999、43 189、43 345，平均值AS=43 251。
　　 標液溶液峰面積的標準不確定度按貝塞爾公式計算：
　　 U（As）==103
　　 Urel（As）=U（As）/As=0.002 4;
　　2.5.2 樣品溶液重復進樣5次測定峰面積 分別為：33 221、33 602、32 621、33 344、33 541，平均值A=33 266。
　　 U（A）==175
　　 Urel（A）=U（A）/A=0.005 3
　　2.6 儀器數據處理系統引入的不確定度
　　 根據儀器說明書和積分儀的一般性能指標分析，目前液相色譜儀峰面積積分處理的最大誤差為0.2%～1.0%，取1.0%，按均勻分布考慮，B 類評定，峰面積的相對不確定度分量U1=1%/3= 5.77×10-3。
　　 液相色譜儀測定用微量進樣器進樣（不確定度1%），按均勻分布考慮，B 類評定，則此項相對不確定度分量U2=1%/3=5.77×10-3。
　　 儀器數據處理系統引入的不確定度：U儀==0.008 2
　　 由此，得到樣品峰面積測量的不確定度評定：U/rel（A）==0.009 8
　　 得到標液峰面積測量的不確定度評定：U/rel （AS）==0.008 5
　　2.7 稱樣量的不確定度評定
　　 根據稱量使用的電子天平檢定證書，其最大允許誤差±0.01 mg，其置信水平99%，按正態分布考慮，包含因子k=3，則標準不確定度為U（m）=0.01 mg/3= 0.003 33 mg。
　　 樣品稱樣量為4.00 g，則其相對標準不確定度為：Urel（m）=0.003 33 mg/4.00 g =8.25×10-4。
　　2.8 樣品處理液定容體積的不確定度評定
　　 樣品經稱提取、凈化預處理后，氮氣吹干，殘留物用1 ml 流動相定容。 　　2.8.1 定容體積的相對標準不確定度定容采用1 ml 單標線吸量管（A級），按照檢定規程JJG 196-2006要求，其最大容量允許誤差為±0.00 7 ml，即相對允許誤差為±0.7%，按矩形分布考慮，B 類評定，則定容體積的相對標準不確定度為Urel（V）=0.7%/3=0. 004 04。
　　2.8.2  1 ml單標線吸量管校準溫度與使用溫度不同引起的體積不確定度
　　 ΔV=V1-V2=（α水-α玻璃）×V×ΔT=1.8×10-4×1×5=9.0×10-4（ml）
　　 按照均勻分布換算成標準偏差為：
　　 ΔV/k=9.0×10-4/=5.2×10-4（ml）
　　 Urel（Vt）=5.2×10-4 ml/1 ml=0. 000 52
　　 由以上2項合成得出Urel（V）==0.004 07
　　2.9 加標回收率的不確定度
　　 因樣品前處理不完全或處理過程中展青霉素的損失，通過添加三聚氰胺（質量濃度50 μg/L）計算加標回收率。實驗結果得到，該法加標回收率為96.5%～101.1%。加標回收率的不確定度按JJF 1059-1999的規定，得到：U2R=。
　　 式中，b+=（101.1-100）%=1.1%，b-=（100-96.5）%=3.5%。
　　 加標回收率的標準不確定度為：UR==0.013 28
　　 所以，前處理過程引起的相對不確定度為：Uel（P）==0.013 46
　　2.10 重復性測量的不確定度
　　 該不確定度屬A類評定，采用同一樣品進行重復實驗進行評估，步驟覆蓋實驗方法的全過程。
　　 測量重復性的標準不確定度為：Ux==0.057
　　 通過表3計算可得試樣中展青霉素含量的最佳估計值為X=25.4 μg/kg，則測量重復性的相對不確定度為：Urel X=Ux/X=0.057/25.4=0.002 2
　　2.11 相對標準不確定度各分量匯總
　　2.12 合成標準不確定度評定
　　 由表4中各相對不確定度合成：
　　Urel（X）==0.082
　　2.13 擴展不確定度評定
　　 擴展不確定度可由合成標準不確定度乘以包含因子，取置信水平95%，則k=2。試樣中展青霉素含量測定的相對擴展不確定度U=Urel（X）×k=0.164。試樣中展青霉素含量的最佳估計值（X）=25.4 μg/kg，其擴展不確定度U=25.4 μg/kg ×0.164=4.17 μg/kg。
　　3 結論
　　 高效液相色譜法測定展青霉素含量，當取樣量為4.0 g，k=2（95% 置信度），測量蘋果汁中展青霉素的含量為（25.4 ±4.17） μg/kg。
　　參考文獻
　　[1] JJG 196-2006，常用玻璃量器檢定規程[S].2006-12-08.
　　[2] GB/T 27418-2017，測量不確定度評定和表示[S].2017-12-29.
　　[3] GB 5009.185-2016，食品安全國家標準 食品中展青霉素的測定[S].2016-12-23.
　　[4] JJF 1059-1999，測量不確定度評定與表示[S]. 1999-01-11.
　　責任編輯：劉赟
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