華木蓮葉片愈傷組織誘導研究

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　　摘要：以華木蓮葉為材料，研究消毒時間、激素濃度配比對華木蓮葉片和葉柄誘導愈傷組織的影響。結果表明：華木蓮葉片和葉柄用濃度為0.1%HgCl2消毒，消毒時間分別為8、5 min，存活率最高，分別為32.15%、49.06%。華木蓮葉片誘導愈傷組織適宜激素濃度配比為1.5 mg/L6-BA+0.15 mg/LIBA，葉柄誘導愈傷組織適宜激素濃度配比為2.0 mg/L 6-BA + 0.15～0.20 mg/L IBA，華木蓮愈傷組織繼代培養適宜培養基為MS + 2.0 mg/L 6-BA +0.15 mg/L IBA。
　　關鍵詞：華木蓮;葉片;激素;愈傷組織
　　中圖分類號：S725.7文獻標識碼：A文章編號：1004-3020（2019）01-0011-05
　　Study on Callus Induction from Leaf Explants of Sinomanglietia glaucaYou RunCao LuyaoLiao WenxuanWang LinglingWang Wenxiu
　　Zhong LipingZheng LiliXing MengxueXiao Zufei
　?。⊿chool of Hydraulic and Ecological Engineering， Nanchang institute technologyJiangxi330099）
　　Abstract： The young leaves and petioles of Sinomanglietia glauca were used as the explants in the study. The experiment studied disinfection time and hormone concentration ratio to young leaves and petioles callus induction of Sinomanglietia glauca. The results showed that the best way to disinfect leaves and petioles of Sinomanglietia glauca were using 0.1% HgCl2 for 8min and 5min， with high survival rate and up to 32.15 % and 49.06 % respectively. The best hormone concentration ratio for leaves of Sinomanglietia glauca was 1.5 mg/L6-BA + 0.15 mg/LIBA. The best hormone concentration ratio for petioles of Sinomanglietia glauca was 2.0 mg/L6-BA + 0.15～0.20 mg/LIBA. The suitable medium for the subculture of Sinomanglietia glauca callus was MS +2.0 mg/L 6-BA +0.15 mg/L IBA.
　　Key words：Sinomanglietia glauca;leaf; hormone;callus
　　華木蓮（Sinomanglietia glauca）木蘭科落葉喬木，樹干通直，樹形優美，花香沁人心肺近乎幽蘭，花色淡黃典雅宛若睡蓮，金秋碩果累累，分布于江西和湖南個別地方，是中國特有珍稀瀕危樹種，也是優良的園林綠化樹[1]。目前，圍繞華木蓮開展的研究有分類學[2-5]、形態解剖學[6-8]、生態學特性[9-10]、分子生物學[11-13]等，取得了一定的成果。本文以華木蓮葉為材料，研究消毒時間、激素濃度配比對華木蓮葉片和葉柄誘導愈傷組織的影響，為瀕危物種華木蓮的無性繁殖研究提供借鑒。
　　1材料與方法
　　1.1試驗材料
　　供試材料來自南昌工程學院木蘭園的華木蓮。2015年6月份選取生長健壯的華木蓮植株，剪取帶葉柄的嫩葉，用自來水沖洗30 min，將葉片主脈去除，修剪成帶2.5 cm見方，葉柄修剪成2～3 cm，待用。
　　1.2試驗方法
　　1.2.1華木蓮葉片組織培養
　　（1）消毒時間對華木蓮葉片初代培養的影響。將修剪好的材料放入無菌罐頭瓶，75%酒精的浸泡30 s，用無菌水沖洗3～5次，用0.1%的升汞（HgCl2）進行消毒，消毒時間分別為3、4、5、6、8、10 min，用無菌水沖洗3～5次，葉片放在無菌濾紙上吸干表面水分，再修剪成0.5 cm見方的小塊，接種在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L培養基。每個處理20瓶，每瓶5～8個葉盤。
　　（2）激素濃度配比對華木蓮葉片誘導愈傷組織的影響。將修剪好的材料放入無菌罐頭瓶，75%酒精的浸泡30 s，用無菌水沖洗3～5次，用0.1%的升汞進行消毒，消毒時間為8 min，用無菌水沖洗3～5次，葉片放在無菌濾紙上吸干表面水分，再修剪成0.5 cm見方的小塊，接種在MS培養基，添加6-BA（0.50、1.00、1.50、2.00 mg/L），IBA（0.05、0.15、0.45、0.60 mg/L）。每個處理20瓶，每瓶5～8個葉盤。
　　1.2.2華木蓮葉柄組織培養
　?。?）消毒時間對華木蓮葉柄初代培養的影響。將修剪好的葉柄放入無菌罐頭瓶，75%酒精的浸泡30 s，用無菌水沖洗3～5次，用0.1%的升汞進行消毒，消毒時間分別為3、5、7、9 min，用無菌水沖洗3-5次，葉片放在無菌濾紙上吸干表面水分，將葉柄兩端剪除1～2 mm，立刻接種在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L培養基。每個處理20瓶，每瓶2～3個葉柄。 　　湖北林業科技第48卷第1期尤潤，等：華木蓮葉片愈傷組織誘導研究（2）激素濃度配比對華木蓮葉柄誘導愈傷組織的影響。將修剪好的葉柄放入無菌罐頭瓶，75%酒精的浸泡30 s，用無菌水沖洗3～5次，用0.1%的升汞進行消毒，消毒時間分別為5 min，用無菌水沖洗3～5次，葉片放在無菌濾紙上吸干表面水分，將葉柄兩端剪除1～2 mm，接種在MS培養基，添加6-BA（0.50、1.00、1.50、2.00 mg/L），IBA（0.05、0.15、0.20、0.50 mg/L）。每個處理20瓶，每瓶2～3個葉柄。
　　1.3數據統計與分析
　　采用Excel2010軟件進行數據的錄入、整理和方差分析。主要調查指標如下：
　　存活率（%）=（存活的外植體數/接種的外植體數）×100
　　污染率（%）=（污染的外植體數/接種的外植體數）×100
　　褐化率（%）=（褐化的外植體數/接種的外植體數）×100
　　愈傷率（%）=（誘導出愈傷組織的外植體數/接種的外植體數）×100
　　2結果與分析
　　2.1華木蓮葉片組織培養
　　2.1.1消毒時間對華木蓮葉片初代組織培養的
　　影響由表1可知，華木蓮莖段消毒3 min，污染率100%，顯著高于其它消毒時間，消毒4 min，污染率降低到85.33%，消毒5 min，污染率降低到58.67%，消毒6 min，污染率降低到42.15%，消毒8 min和10 min，污染率較低，分別為26.33%和24.13%，之間差異不顯著。消毒3 min和4 min，褐化率較低，分別為25.17%和23.67%，之間差異不顯著;消毒5 min、6 min和8 min，褐化率顯著提高，褐化率35%左右;消毒10 min，褐化率最高，為65.83%。存活率呈現先升后降的變化趨勢，消毒8 min，存活率最高，為32.15%，之后存活率顯著下降。因此，隨著消毒時間的增加，華木蓮葉片組織培養污染率逐漸降低，而褐化率逐漸升高，存活率先升后降。綜合污染率、褐化率和存活率3個指標，華木蓮葉片組織培養消毒最佳時間為8 min。
　　2.1.2激素濃度配比對華木蓮葉片誘導愈傷組織的影響
　　由表2可知，在IBA濃度不變的情況下，隨著6-BA濃度的增加，華木蓮葉片的誘導愈傷率呈現逐漸升高的趨勢。6-BA濃度為1.5 mg/L和2.0 mg/L，愈傷組織誘導率最高，分別為38.17%和35.83%，之間差異不顯著，顯著高于處理1和處理2，葉盤四周形成大量愈傷組織，誘導出愈傷組織時間短，愈傷組織生長快，顏色為白色，疏松、質量好（圖1），而處理1和處理2，葉盤四周形成愈傷組織較少，愈傷組織增殖較慢，顏色為黃色、密實、堅硬，有的部分褐化、發黑。6-BA濃度不變，華木蓮葉片誘導愈傷率隨著IBA濃度的增加呈現先升后降趨勢。IBA濃度0.15 mg/L誘導愈傷率最高，為38.17%，顯著高于其它處理，愈傷組織質量最好。因此，華木蓮葉片誘導愈傷組織形成適宜激素配比為1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IBA。
　　2.2華木蓮葉柄組織培養
　　2.2.1消毒時間對華木蓮葉柄初代培養的影響
　　由表3可知，華木蓮葉柄消毒3 min，污染率46.94%，顯著高于其它消毒時間，消毒5 min和7 min污染率顯著降低，消毒9 min，污染率最低，降低到13.33%。褐化率隨著消毒時間的增加，顯著升高。存活率呈現先升后降的變化趨勢。綜合污染率、褐化率和存活率3個指標，華木蓮葉柄組織培養消毒最佳時間為5 min，相對于葉片，葉柄較容易消毒，污染率和褐化率低，存活率高。
　　2.2.2激素濃度配比對華木蓮葉柄誘導愈傷組織的影響
　　由表4可知，在IBA濃度不變的情況下，隨著6-BA濃度的增加，華木蓮葉柄誘導愈傷率呈現逐漸升高的趨勢。6-BA濃度為2.0 mg/L時，愈傷組織誘導率最高，為35.33%，切口有較多愈傷組織形成，愈傷組織生長快，乳白色、疏松，愈傷組織質量好（圖2）。6-BA濃度不變，華木蓮葉柄誘導愈傷率隨著IBA濃度的增加呈現先升后降趨勢。IBA濃度0.2 mg/L誘導愈傷率最高，為33.83%，切口有較多愈傷組織形成，愈傷組織生長快，白色、疏松，愈傷組織質量最好，與0.15mg/L處理差異不顯著。因此，華木蓮葉柄誘導愈傷組織形成最適激素配比為MS+2.0mg/L 6-BA+0.15～0.2 mg/L IBA。
　　2.3華木蓮愈傷組織繼代培養
　　華木蓮愈傷組織繼代培養（圖1、圖2），采用MS+2.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IBA培養基，愈傷組織增殖速度快，15 d左右基本能夠蓋滿整個培養基，需及時繼代，否則愈傷組織老化、發黑，最總死亡。
　　3討論與結論
　　葉是植物組織培養常用外植體，影響葉片組織培養的因素較多，如基因型[14]、葉齡[15]、消毒時間[16]、激素[17]等。外植體消毒時間長短，影響外植體污染率和褐化率，直接影響外植體的成活率。有研究表明，桂花嫩葉組織培養使用0.1%HgCl2溶液消毒5 min，消毒效果較好，無菌存活率達到66.70%[18]。中華枸杞嫩葉采用0.1%HgCl2溶液消毒8 min效果最好，污染率和死亡率低[19]。本研究結果表明，華木蓮葉片采用0.1%HgCl2溶液消毒8 min，葉柄消毒5 min，效果最好，存活率最高，分別為32.15%、49.16%。
　　外源激素是植物葉片組織培養成功的關鍵因子。不同激素對植物葉片誘導愈傷組織的影響不同，同一激素不同濃度對植物葉片誘導愈傷組織的影響也不同。侯思宇[20]等研究BA、TDZ和IBA對櫻桃葉片離體再生過程中出愈率、出芽率的影響。結果表明，2.0 mg/LBA對櫻桃葉片出愈率、出芽率有顯著影響，TDZ和IBA對櫻桃葉片再生體系建立影響不大。湯飛云[21]等研究結果表明，2，4-D對黑莓葉片愈傷組織的誘導和愈傷組織的 　　生長狀態效果較好，培養基中添加1.0 mg/L 2，4-D誘導的愈傷組織多，質地疏松，愈傷組織為嫩黃色。本研究結果表明，華木蓮葉片誘導愈傷組織適宜激素濃度配比為1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IBA，愈傷率38.17%，葉柄誘導愈傷組織適宜激素濃度配比為2.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IBA，愈傷率35.33%，華木蓮愈傷組織繼代培養適宜培養基為MS+2.0 mg/L 6-BA +0.15 mg/L IBA。
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