青光安有效組分對兔青光眼術后濾過道瘢痕組織中膠原纖維、成纖維細胞特異性蛋白-1、結締組織生長因子及轉化生長因子-β1表達的影響

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　　 摘要：目的  觀察青光安4種有效組分對兔青光眼術后濾過道瘢痕組織中膠原纖維、成纖維細胞特異性蛋白-1（FSP-1）、結締組織生長因子（CTGF）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）表達的影響，對比青光安4種有效組分及青光安混懸液抗濾過道瘢痕化的效果。方法  采用青光眼濾過手術制作動物模型。實驗兔按體質量隨機分為空白組（A組）、模型組（手術對照組，B組）、絲裂霉素C組（C組）、有效組分1組（D組）、有效組分2組（E組）、有效組分3組（F組）、有效組分4組（G組）和青光安混懸液組（H組）。各給藥組給予相應藥物。觀察各組兔濾過道瘢痕組織中膠原纖維、FSP-1、CTGF、TGF-β1水平。結果  術后C、E、H組兔眼壓回升緩慢，眼壓值較術前和A組差異均有統計學意義（P<0.05）;膠原纖維面積比值除B、D、G組外，其他各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）;FSP-1表達除B、G組外，其他各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）;CTGF表達除B、D、G組外，其他各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）;TGF-β1表達除B、G組外，其他各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。結論  青光安有效組分2、絲裂霉素C及青光安混懸液通過抑制膠原纖維、FSP-1、CTGF、TGF-β1的表達，降低肌成纖維細胞和成纖維細胞的增殖，從而減少濾過道瘢痕組織的增生，有明顯抗青光眼術后濾過道瘢痕化的作用，青光安有效組分2和青光安混懸液抑制濾過道瘢痕化效果基本相當。
　　關鍵詞：青光安有效組分;青光眼;濾過道瘢痕化;膠原纖維;成纖維細胞特異性蛋白-1;結締組織生長因子;轉化生長因子-β1;兔
　　中圖分類號：R285.5    文獻標識碼：A    文章編號：1005-5304（2019）05-0059-05
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.013 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：
　　Abstract： Objective To observe the effects of effective components of Qingguang'an on collagen fibers， fibroblast-specific protein-1 （FSP-1）， connective tissue growth factor （CTGF） and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） in rabbits after glaucoma surgery; To compare the four effective components of Qingguang'an and the effects of Qingguang'an suspension on scarring of filtration passage. Methods Glaucoma filtering surgery was used to make animal models. The rabbits were randomly divided into blank group （group A）， model group （surgical control group， group B） and mitomycin C group （group C）， effective component 1 group （group D）， effective component 2 group （group E）， effective component 3 group （group F）， effective component 4 group （group G） and Qingguang'an suspension group （group H） according to body weight. Each administration group was given relevant medicine. The levels of collagen fibers， FSP-1， CTGF and TGF-β1 in the scar tissue of rabbit filtration passage in each group were observed. Results After surgery， the intraocular pressures of group C， E and H were slow， with statistical significance  compared with preoperation and group A， （P<0.05）. The area ratio of collagen fibers was statistically significant  except for the comparison among group B， D and G （P<0.05）. The expression of FSP-1 was statistically significant among the other groups except for the comparison between group B and group G （P<0.05）. The expression of CTGF was statistically significant among the other groups except for the comparison among group B， D and G （P<0.05）. The expression of TGF-β1 was statistically significant among the other groups except for the comparison between group B and G group （P<0.05）. Conclusion Effective component 2 in Qingguang'an， mitomycin C and Qingguang'an suspension can reduce the proliferation of myofibroblasts and fibroblasts by inhibiting the expressions of collagen fibers， FSP-1， CTGF and TGF-β1， and show obvious anti-glaucoma scarring effect after filtration. The efficacy of effective component 2 in Qingguang'an and Qingguang'an suspension for inhibiting the scarring of the filtration passage is basically the same. 　　Keywords： effective components of Qingguang'an; glaucoma; filtration scarring; collagen fibers; fibroblast- specific protein-1; connective tissue growth factor; transforming growth factor-β1; rabbits
　　青光眼致盲率高，目前治療方式主要是進行濾過性手術，而濾過道瘢痕化是濾過性手術失敗最主要的原因。盡管抗代謝藥物如絲裂霉素C在手術中應用大大提高了手術成功率，但此類藥物廣泛作用于眼部組織，會導致濾過泡滲漏、眼內感染等一系列并發癥，易給患者本來已損傷的視功能帶來新的威脅[1-2]。本課題組自主研制的青光安顆粒劑具有活血化瘀、利水明目的功效，用于術后抗濾過道瘢痕化療效顯著[3-5]。前期通過在青光安顆粒劑中藥組分庫中建立高通量篩選藥物體系[6-7]，已篩選出4種青光安有效組分。本實驗將4種青光安有效組分、青光安混懸液及絲裂霉素C應用于手術動物模型，觀察各組兔濾過道瘢痕組織中膠原纖維、成纖維細胞特異性蛋白-1（FSP-1）、結締組織生長因子（CTGF）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）的表達及抑制瘢痕組織增生的效果，對比各有效組分抗濾過道瘢痕化的實際療效，為研制治療青光眼的藥物提供依據。
　　1  實驗材料
　　1.1  動物
　　SPF級新西蘭長耳白兔48只，湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，體質量1.5～2.0 kg，雌雄各半，實驗前排除雙眼及全身病變。飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心SPF級動物房，溫度（23±2）℃，相對濕度50%～55%，自由攝食飲水。
　　1.2  藥物
　　水合氯醛，上海國藥集團;絲裂霉素C，上海士鋒生物科技有限公司，貨號A1400;青光安4種有效組分，湖南中醫藥大學藥學院中藥化學教研室;青光安（黃芪、赤芍、地龍、車前子、白術、茯苓等）顆粒，湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供，用滅菌蒸餾水配制成混懸液。
　　1.3  主要試劑與儀器
　　4%多聚甲醛，武漢博士德生物工程有限公司;兔抗人成纖維細胞特異性蛋白單克隆抗體，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號GB11397;兔抗人結締組織生長因子單克隆抗體，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號GB11078;兔抗人轉化生長因子單克隆抗體，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號GB11271;SABC即用型試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司，批號SA1022;DAB試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司，批號SA2025。超低溫冰箱（中科美菱，DW-HL538），立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司醫療設備廠，YXQ-LS-SⅡ），凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司，SW-CJ-1D），電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，101-1AB型），低溫臺式高速離心機（赫西儀器裝備有限公司），超微量分光光度計（美國Nanodrop公司），凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司），微量移液器（德國Eppendorf公司），臺式高速冷凍離心機（美國Thermo公司），水平電轉槽（北京六一儀器廠，DYCP-40C），超純水儀（美國Millipore公司），紫外可見分光光度計（上海Spectrum公司，SP-752），恒溫搖床（常州金壇，THZ-82A），水平搖床（北京六一儀器廠，WD-9405B），掃描儀（日本Canon）。
　　2  實驗方法
　　2.1  分組
　　實驗兔按體質量隨機分為空白組（A組）、模型組（手術對照組，B組）、絲裂霉素C組（C組）、有效組分1組（D組）、有效組分2組（E組）、有效組分3組（F組）、有效組分4組（G組）和青光安混懸液組（H組），每組6只。
　　2.2  造模
　　10%水合氯醛溶液（2～4 mL/kg）兔耳緣靜脈注射麻醉，使用壓陷式眼壓計測每只兔術眼3次眼壓，取平均值并記錄。生理鹽水沖洗術眼結膜囊后滴0.1%丁卡因進行局部麻醉，在手術顯徼鏡下行雙眼小梁切除+虹膜根部切除術[8]。
　　2.3  給藥
　　A、B組術后第l日開始給予生理鹽水灌胃;C組術中切除鞏膜和小梁組織前給予絲裂霉素C;D、E、F、G組術后第1日開始給予青光安不同組分，按體表面積折算等效劑量比值計算給藥，溶于生理鹽水;H組術后第1日開始給予成人臨床等效劑量3.27倍青光安混懸液，溶于生理鹽水。給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續4周。
　　2.4  術后眼壓測量及取材
　　眼壓參照文獻[8]方法測量。灌胃4周后第1日取材，空氣栓塞法處死兔，立即摘取眼球4%多聚甲醛固定[6]，剪取手術區10 mm×10 mm范圍內的方形全層眼球壁及其周邊組織，石蠟切片，備行Masson染色。
　　2.5  膠原纖維、成纖維細胞特異性蛋白-1、結締組織生長因子和轉化生長因子-β1的表達檢測
　　取4份石蠟切片Masson染色，1份光鏡400倍視野下隨機選擇5個高倍視野，觀察膠原纖維占視野面積比值，另外3份各隨機選取5個高倍視野分別測量FSP-1、CTGF、TGF-β1的平均光密度值。
　　3  統計學方法
　　采用SPSS19.0統計軟件進行分析。實驗數據以±s表示，組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。
　　4  結果
　　4.1  青光安有效組分對模型兔眼壓的影響
　　同一時間不同組眼壓情況：手術后各組眼壓均明顯下降，且手術后1周內各組均有抑制眼壓的效果;手術后2周B、G組眼壓基本恢復到術前水平;手術后4周C、E、F、H組手術效果依然存在，該4組所用藥物對術后抑制眼壓上升均有一定效果，其中以C組效果最好，F組較差。同一組不同時間段眼壓情況：B組術后2、4周與術前比較差異無統計學意義（P>0.05），說明B組手術2周后眼壓基本恢復到術前水平;C組術后各時間段與術前比較差異有統計學意義（P<0.05），說明C組在手術后眼壓均處于較低水平;D組術后4周較術前差異無統計學意義（P>0.05），說明D組對抑制眼壓上升無明顯作用;E組術后各時間段相比術前差異有統計學意義（P<0.05），說明E組對抑制眼壓上升有效;F組術后各時間段較術前差異均有統計學意義（P<0.05），說明F組對抑制眼壓上升有效;G組術后各時間段較術前差異有統計學意義（P<0.05），說明G組對于抑制眼壓上升有效;H組術后各時間段較術前差異有統計學意義（P<0.05），說明H組對抑制眼壓上升有效。結果見表1。 　　4.2  青光安有效組分對模型兔濾過泡區膠原纖維表達的影響
　　A組膠原纖維較少，形態規則，排列整齊;B組膠原纖維大量增生，排列不規則;C組膠原纖維增生較少，排列尚規則;D組膠原纖維增生較多，排列較為紊亂;E組膠原纖維密度較低，排列尚規則;F組可見大量生成的膠原纖維排列不規則;G組膠原纖維致密粗大，排列不規則;H組膠原纖維排列稀疏，且邊界清楚。各組濾過泡區膠原纖維面積比值較A組差異有統計學意義（P<0.05），說明各組濾過泡區膠原纖維都有不同程度增殖;D、G組較B組差異無統計學意義（P>0.05），說明D、G組對抑制膠原纖維增殖基本無效;C、E、F、H組較B組差異有統計學意義（P<0.05），說明C、E、F、H組對抑制膠原纖維增殖有效;H組較E組差異無統計學意義（P>0.05），說明其抑制膠原纖維增殖效果與E組無明顯差異。結果見表2、圖1。
　　4.3  青光安有效組分對模型兔濾過泡區成纖維細胞特異性蛋白-1表達的影響
　　各組FSP-1平均光密度較A組差異有統計學意義（P<0.05）。G組較B組差異無統計學意義（P>0.05），說明G組對于抑制FSP-1表達基本無效;而C、D、E、F、H組較B組差異有統計學意義（P<0.05），說明C、D、E、F、H組對抑制FSP-1表達有效;H組較E組差異無統計學意義（P>0.05），說明其抑制FSP-1表達與E組無明顯差異。結果見表3。
　　4.4  青光安有效組分對模型兔濾過泡區結締組織生長因子表達的影響
　　各組CTGF平均光密度較A組差異有統計學意義（P<0.05）。D、G組較B組差異無統計學意義（P>0.05），說明D、G組對抑制CTGF表達基本無效;而C、E、F、H組較B組差異有統計學意義（P<0.05），說明C、E、F、H組對抑制CTGF表達有效;H組較E組差異無統計學意義（P>0.05），說明其抑制CTGF表達與E組無明顯差異。結果見表3。
　　4.5  青光安有效組分對模型兔濾過泡區域轉化生長因子-β1表達的影響
　　各組TGF-β1平均光密度較A組差異有統計學意義（P<0.05）。G組較B組差異無統計學意義（P>0.05），說明G組對抑制TGF-β1表達基本無效。而C、D、E、F、H組較B組差異有統計學意義（P<0.05），說明C、D、E、F、H組對抑制TGF-β1表達有效;H組較E組增殖效果差異無統計學意義（P>0.05），說明其抑制TGF-β1表達與E組無明顯差異。結果見表3。
　　5  討論
　　青光眼術后濾過道瘢痕化是青光眼濾過性手術失敗的主要原因[9]，一般認為瘢痕形成主要與膠原纖維合成增多、成纖維細胞及肌成纖維細胞的增生有關。
　　FSP-1是S100蛋白家族成員之一，通過多種途徑調控細胞的增殖與分化，在腫瘤轉移中作用明顯。有研究報道，FSP-1參與抗青光眼術后濾過道的瘢痕化，可能與其促進細胞骨架蛋白表達有關，FSP-1也可引起抗青光眼術后小梁組織硬度的改變，參與了抗青光眼術后眼壓、濾過道瘢痕化等[10-11]。TGF-β1是導致抗青光眼術后濾過道瘢痕化的主要細胞因子，TGF-β1的高表達可促進上皮細胞轉化為成纖維細胞[12]，而成纖維細胞的增生會直接導致抗青光眼術后濾過道瘢痕化，從而導致抗青光眼手術失敗。CTGF是TGF-β1的下游信號因子[13-14]，在許多纖維化病的病理生理學中起關鍵作用，有研究表明，CTGF在TGF-β1誘導的細胞外基質產生和肌成纖維細胞轉化中高度表達[15]，通過降低CTGF表達水平，可顯著減少肌成纖維細胞轉化，從而減少抗青光眼術后濾過道瘢痕化，提高手術成功率。
　　本實驗以青光安4個有效組分與空白組、模型組、絲裂霉素C組及青光安混懸液組進行比較，在術后眼壓、濾過道瘢痕化方面對4種組分療效進行研究，結果發現絲裂霉素C、有效組分2和青光安混懸液均能有效控制青光眼濾過性手術術后眼壓;絲裂霉素C、有效組分2和有效組分3均可有效抑制膠原纖維增殖，其中絲裂霉素C效果最佳;絲裂霉素C對FSP-1增殖有明顯的抑制作用，有效組分2與青光安混懸液組也可有效抑制FSP-1表達，有效組分4對FSP-1表達幾乎無抑制作用;絲裂霉素C對CTGF表達有明顯抑制作用，青光安混懸液、有效組分2及有效組分3對CTGF表達均有抑制作用，有效組分4組與有效組分l組對CTGF表達抑制作用不明顯;絲裂霉素C對TGF-β1表達有明顯的抑制作用，有效組分2和青光安混懸液組也可有效抑制TGF-β1表達，有效組分4對TGF-β表達無抑制作用
　　綜上，絲裂霉素C、青光安有效組分2及青光安混懸液通過抑制FSP-1、CTGF、TGF-β1的表達而發揮對肌成纖維細胞及成纖維細胞的抑制作用，具有明顯的抗瘢痕化作用。
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　?。ㄐ藁厝掌冢?018-11-14;編輯：華強）
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