不同月齡肉羊肌內結締組織中Ⅴ型膠原蛋白的特性

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　　摘 要：采用自然放牧條件下的6、9、12、18 月齡烏珠穆沁羊，取其半腱肌（Semitendinosus，ST）和背最長肌（Longissimus dorsi，LD），提取并分離純化肌內結締組織中的Ⅴ型膠原蛋白。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）、熱變性溫度和氨基酸組成分析，比較各月齡段肉羊不同部位中Ⅴ型膠原蛋白的特性。結果表明：Ⅴ型膠原蛋白主要由α1（Ⅴ）、α2（Ⅴ）、α3（Ⅴ） 3 種亞基組成;ST和LD肌內結締組織中Ⅴ型膠原蛋白的含量隨著月齡的增長而增加，且各月齡間差異顯著（P<0.05）;在同一月齡段，ST肌內結締組織中Ⅴ型膠原蛋白的含量高于LD;FTIR分析表明，各月齡段ST和LD肌內結締組織中的Ⅴ型膠原蛋白均出現了主要吸收峰酰胺A、B及酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ;ST肌內結締組織中Ⅴ型膠原蛋白的熱變性溫度隨著月齡的增長而顯著升高（P<0.05），但9、12 月齡間無顯著差異（P>0.05）;LD肌內結締組織中Ⅴ型膠原蛋白的熱變性溫度隨著月齡的增長而升高，但9、12 月齡及12、18 月齡間無顯著差異（P>0.05），其他月齡均差異顯著（P<0.05）;氨基酸組成分析結果表明，Ⅴ型膠原蛋白的總氨基酸、亞氨基酸及羥脯氨酸含量隨著月齡的增長而呈上升趨勢，且各月齡間有顯著差異（P<0.05）。本研究解釋了隨著肉羊月齡的增加，其骨骼肌肌內結締組織中Ⅴ型膠原蛋白的特性變化。
　　關鍵詞：烏珠穆沁羊;Ⅴ型膠原蛋白;變性溫度;氨基酸
　　Abstract： A comparative characterization of the type Ⅴ collagens extracted from the intramuscular connective tissues of Semitendinosus （ST） and Longissimus dorsi （LD） muscles in naturally grazed Ujimqin sheep aged 6， 9， 12 and 18 months was performed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）， Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）， thermal denaturation temperature and amino acid composition analysis. The results showed that the type Ⅴ collagens consisted of three different subunits （α1（Ⅴ）， α2（Ⅴ） and α3（Ⅴ））. For both muscles， the content of type Ⅴ collagen was increased significantly （P < 0.05） with age. At each age group， the content of type Ⅴ collagen in ST was higher than in LD. FTIR analysis showed the amide A， B， Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ absorption bands of the type Ⅴ collagens in ST and LD muscles at each age group. The denaturation temperature of type V collagen in ST was significantly increased with age（P < 0.05）， although no significant difference （P > 0.05） was observed between 9- and 12- month-old sheep. The Td of type Ⅴ collagen in LD was increased with age （P > 0.05）， except that there was no significant difference between 9 and 12 months and between 12 and 18 months of age. Amino acid analysis indicated that total amino acid content and imino acid contents （hydroxyproline and proline） were significantly increased with age （P < 0.05）. This study provides a theoretical foundation for explaining the effect of collagen on meat quality.
　　Keywords： Ujimqin sheep; type Ⅴ collagen; thermal denaturation temperature; amino acidDOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190117-015
　　中圖分類號：TS251.1                                       文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）03-0007-07 　　引文格式：
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　　家畜肌肉硬度有固有硬度和尸僵硬度，其中固有硬度主要來自于骨骼肌肌內結締組織（intramuscular connective tissue，IMCT）的膠原蛋白[1]。不同品種、甚至同一品種不同年齡階段的家畜肌肉組織中膠原蛋白的含量、熱穩定性、膠原蛋白分子內和分子間的交聯程度等均有很大差距。IMCT的熱穩定性和機械穩定性隨動物的生長而增加，這與膠原蛋白分子間共價交聯的化學性質和膠原蛋白的氨基酸組成有關[2]。在幼齡動物的結締組織中，大多數交聯以不穩定的席夫堿形式存在，對酸和熱不穩定，容易受到膠原蛋白酶和離子強度的變化及溫度的作用而降解[3]。隨著動物的生長，可還原交聯被轉化為更穩定的非還原交聯，結締組織對酸和熱的敏感性降低，加熱后的膠原蛋白可溶性下降，降低了肌肉的嫩度[4]。研究發現，骨骼肌IMCT中主要有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白，其中含量較多的是Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白[5]，因此對于不同品種骨骼肌中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的研究較多[6-7]，
　　但對于含量較少、提取過程較為復雜的Ⅴ型膠原蛋白特性的研究報道較少。Ⅴ型膠原蛋白和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白均屬于纖維狀膠原蛋白，纖維狀膠原蛋白的共同結構特征是中心有一個長的膠原結構域，含有1 000多個氨基酸，由Gly-Xaa-Yaa重復序列組成，其中Xaa和Yaa位置是任一種氨基酸（或亞氨基酸）殘基[8]。當Xaa位和Yaa位均為亞氨基酸時（Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-Hyp），膠原蛋白的熱穩定性最高[9]。分析膠原蛋白氨基酸組成發現，甘氨酸含量最高，其含量隨著來源的不同在28.6%～35.6%之間變化，不含色氨酸，亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）含量較高，羥脯氨酸含量是衡量膠原蛋白熱穩定性的重要指標，其含量越高，膠原蛋白的熱穩定性越高[10]。本研究采用放牧飼養的不同月齡（6、9、12、18 月）的烏珠穆沁羊，提取半腱肌（Semitendinosus，ST）和背最長肌（Longissimus dorsi，LD）中Ⅴ型膠原蛋白，對其進行蛋白質含量、熱變性溫度、氨基酸組成及傅里葉紅外光譜分析，解析骨骼肌肌內結締組織Ⅴ型膠原蛋白的特性。這對膠原蛋白特性與肉品質的關系研究具有重要意義。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料與試劑
　　樣品來自內蒙古自治區錫林郭勒盟東烏珠穆沁旗，選取6、9、12、18 月齡烏珠穆沁羊，所選的各月齡肉羊是同一個羊群中年齡相同的去勢公羊，每個月齡選取6 只羊作為平行。將肉羊屠宰后取半腱肌和背最長肌，適當分割后于液氮中速凍，然后存放于-80 ℃冰箱，冷凍保存備用。胃蛋白酶（1∶10 000）、N-馬來乙酰胺、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、對二甲基苯甲醛 北京索萊寶科技有限公司;三羥基氨基甲烷（Tris堿）、過硫酸銨（ammonium sulfate，APS）、四甲基乙二胺（N，N，N’，N’-tetramethylethylenediamine，TEMED） 美國Sigma公司;乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA）   天津市科盟化工工貿有限公司;氯胺T 國藥集團化學試劑有限公司;L-羥脯氨酸 北京酷來搏科技有限公司;所有分離用有機溶劑均為國產分析純。
　　1.2 儀器與設備
　　XHF-DY高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司;CP-100超速離心機、L-8900全自動氨基酸分析儀 日本Hitachi公司;BG-Power電泳儀 北京白晶生物技術有限公司;DZ-3335差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC） 南京大展機電技術有限公司;IRAffinity-1傅里葉紅外光譜儀 日本Shimadzu公司;TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。
　　1.3 方法
　　1.3.1 Ⅴ型膠原蛋白的提取
　　參考Chandra[11]、永井裕[12]等的方法，并做適當調整。整個提取過程均在4 ℃條件下進行。樣品在4 ℃條件下解凍，稱取150 g骨骼肌組織，剔除肌外膜和脂肪后切碎，加入10 倍量的勻漿液（用5 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）配制的10 g/100 mL NaCl），在3 000 r/min條件下勻漿30 s，此步驟重復3 次;攪拌之后離心（10 000×g，5 min），去除脂肪等其他組織，取沉淀加入10 倍量的洗凈液（含10 mmol/L EDTA、10 mmol/L PMSF、12.5 μg/mL N-馬來酰胺），反復沖洗5 次;10 000×g離心15 min，取沉淀加入胃蛋白酶（胃蛋白酶質量∶樣品濕質量=1.5∶1），15 ℃消化48 h，100 000×g離心1 h，取上清液，加NaCl至濃度為0.7 mol/L，攪拌過夜;100 000×g離心1 h，取上清液，加NaCl至濃度為0.5 mol/L，攪拌過夜;100 000×g離心1 h，取沉淀，沉淀溶解于用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）配制的1.0 mol/L NaCl中;100 000×g離心1 h，取上清液，加入NaCl至濃度為4.5 mol/L，攪拌過夜;100 000×g離心1 h，取沉淀，沉淀溶解于0.1 mol/L的Hac，加NaCl至濃度為1.2 mol/L，攪拌過夜;100 000×g離心1 h，取沉淀，沉淀溶解于用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）配制的1.0 mol/L NaCl中，在同一個緩沖液中進行透析，100 000×g離心1 h取沉淀，沉淀即為Ⅴ型膠原蛋白。冷凍干燥后-20 ℃保存備用。 　　1.3.2 Ⅴ型膠原蛋白十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分析
　　參考Leammli[13]的方法。采用不連續Tris-HCl/甘氨酸緩沖系統、8%的分離膠和5%的濃縮膠，稱取一定量的冷凍干燥Ⅴ型膠原蛋白待測樣，溶解于0.5 mol/L醋酸，與5×上樣緩沖液（1 mol/L pH 6.8 Tris-HCl，50%丙三醇，β-巰基乙醇，1%溴酚藍，10% SDS）以4∶1的比例混合，使Ⅴ型膠原蛋白的質量濃度為1 mg/mL，100 ℃水浴5 min;在10 000 r/min轉速下離心10 min后取上清液，抽取15 μL分別加入加樣孔，以同樣的量取Marker加入樣品孔，100 V恒壓電泳，待指示液移到離邊緣約1 cm處，停止電泳;凝膠用0.1%考馬斯亮藍R-250（含60 mL無水乙醇、14 mL冰乙酸、0.14 g考馬斯亮藍R-250、60 mL蒸餾水）進行染色，染色結束后在醋酸脫色液（含100 mL無水乙醇、30 mL冰乙酸和270 mL蒸餾水）中進行脫色，凝膠成像儀掃描分析。
　　1.3.3 Ⅴ型膠原蛋白含量的測定
　　參考Bergman等[14]的方法，并稍作調整。準確稱取冷凍干燥的Ⅴ型膠原蛋白待測樣30 mg置于具塞試管中，加入6 mol/L HCl，115 ℃水解12 h后加入2 mL氧化劑（含7 g/100 mL氯胺T、74% 26%異丙醇、0.629 mol/L NaOH、0.14 mol/L檸檬酸、0.453 mol/L乙酸鈉和0.112 mol/L冰乙酸）充分混合，靜置20 min，加入30 mL對二甲基苯甲醛（將2 g對二甲基苯甲醛溶解于3 mL 60%高氯酸，與異丙醇按3∶13的比例混合），65 ℃水浴20 min，冷卻后采用紫外分光光度計于558 nm波長處測定吸光度。
　　1.3.4 傅里葉紅外光譜檢測
　　將2 mg冷凍干燥的Ⅴ型膠原蛋白待測樣與2 mg KBr混合，研磨成粉并壓制成薄片，置于傅里葉紅外光譜儀內，在400～4 000 cm-1頻率范圍內進行掃描，分辨率為4 cm-1，掃描信號累加200 次[15]。
　　1.3.5 Ⅴ型膠原蛋白熱變性溫度的測定
　　準確稱取冷凍干燥的Ⅴ型膠原蛋白待測樣10 mg，置于鋁坩堝并壓實密封后以相同質量的鋁坩堝為空白組，置于差式掃描熱量儀內，在20～150 ℃溫度范圍內以1 ℃/min的速率進行測定[16]。
　　1.3.6 Ⅴ型膠原蛋白氨基酸組成分析
　　參考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》[17]。將80 mg冷凍干燥的Ⅴ型膠原蛋白待測樣置于具塞試管內，加入6 mol/L HCl至15 mL，抽真空封管，110 ℃水解24 h后，過濾，定容至50 mL;取1 mL減壓蒸干后，加入0.02 mol/L的鹽酸溶解，利用氨基酸自動分析儀測定膠原蛋白氨基酸組成。實驗條件為：4.6 mm×60 mm分析柱，2622#樹脂;柱溫57 ℃;反應溫度135 ℃。其中以檸檬酸-檸檬酸鈉作為緩沖液，以茚三酮作為顯色液。
　　1.4 數據處理
　　實驗數據用平均值±標準差（n=3）表示。2 組間比較采用T-test檢驗，P<0.05表示有顯著差異。采用SPSS軟件對數據進行分析，傅里葉紅外光譜圖線采用Origin 7.0軟件進行分析。
　　2 結果與分析
　　2.1 SDS-PAGE結果1～4分別為6、9、12、18 月齡ST;5～8分別為6、9、12、18 月齡LD;M為Marker。
　　由圖1可知，Ⅴ型膠原蛋白條帶清晰，均出現了3 條肽鏈，推測其亞基組成為α1（Ⅴ）、α2（Ⅴ）、α3（Ⅴ），符合Ⅴ型膠原蛋白的結構特征，是Ⅴ型膠原蛋白常見的一種亞型。研究發現，Ⅴ型膠原是一種含量較少、組織分布廣的纖維型膠原，并且至少有4 種同分異構體，包括2α1（Ⅴ）α2（Ⅴ）、α1（Ⅴ）α2（Ⅴ）α3（Ⅴ）、3α3（Ⅴ）、Ⅴ型膠原蛋白α鏈和Ⅺ型膠原蛋白α鏈的混合[18]。不同月齡、不同骨骼肌中Ⅴ型膠原蛋白3 種肽鏈呈現出相同的分子質量，條帶及其顏色深淺差別不大。
　　2.2 骨骼肌肌內結締組織中Ⅴ型膠原蛋白的含量
　　大寫字母不同，表示同一肌肉部位、不同月齡間差異顯著（P<0.05）;*. 同一月齡、不同肌肉部位間差異顯著（P<0.05）。圖7同。
　　由圖2可知：ST和LD肌內結締組織中的Ⅴ型膠原蛋白含量隨著月齡的增長而增加，且各月齡間差異顯著（P<0.05）;同一月齡，ST肌內Ⅴ型膠原蛋白的含量均高于LD;6 月齡和9 月齡ST和LD中肌內Ⅴ型膠原蛋白的含量沒有顯著差異（P>0.05），12 月齡和18 月齡時差異顯著（P<0.05）。研究表明，膠原蛋白的含量受肌肉運動量的影響，與運動量較少的肌肉相比，經常運動的肌肉中肌束膜由更多膠原纖維束組成且較發達[19]，膠原蛋白含量較高，肌束較粗，肉質較硬。各部位肉中所含膠原蛋白的含量不同，其嫩度也不同。Dubost等[20]的研究發現，股二頭肌內膠原蛋白含量最高，其次是ST和LD。
　　2.3 Ⅴ型膠原蛋白的二級結構分析
　　a、b、c、d分別為6、9、12、18 月齡烏珠穆沁羊ST肌內結締組織Ⅴ型膠原蛋白。圖5同。
　　采用傅里葉紅外光譜分別分析6、9、12、18 月齡烏珠穆沁羊ST和LD肌內結締組織中Ⅴ型膠原蛋白的二級結構（三股螺旋結構）。由圖3～4可知，各月齡烏珠穆沁羊骨骼肌肌內結締組織中Ⅴ型膠原蛋白的紅外光譜特征基本一致，均具有Ⅴ型膠原蛋白的特征紅外吸收峰。 　　a、b、c、d分別為6、9、12、18 月齡烏珠穆沁羊LD肌內結締組織Ⅴ型膠原蛋白。圖6同。
　　由表1可知，酰胺A是由肽鏈上羰基的N-H基團伸縮振動而引起的特征峰[21]，在3 400～3 440 cm-1范圍內N-H基團發生自由的伸縮振動，然而，當N-H基團參與氫鍵的形成時N-H伸縮振動出峰的波數向低頻
　　移動[22]。各月齡LD中Ⅴ型膠原蛋白酰胺A的吸收峰均在波數3 230 cm-1處，但12和18 月齡ST中酰胺A出現略微向低頻移動現象，說明有更多的N-H基團參與氫鍵的形成，從而使膠原蛋白螺旋結構結合在一起[23]，這也是隨著月齡的增加，膠原蛋白的熱變性溫度增大的可能原因。酰胺B是由CH2不對稱伸縮振動引起的特征峰[24]，各月齡Ⅴ型膠原蛋白均在波數3 000 cm-1處有吸收峰，但6、9 月齡LD中有向低頻移動現象，說明隨著月齡的增長，Ⅴ型膠原蛋白羧基之間有更多的分子結合[25]。
　　酰胺Ⅰ主要與膠原蛋白多肽鏈的羧基C=O伸縮振動有關[26]，是膠原蛋白二級結構變化的敏感區域，與膠原蛋白分子的序度有關。Ⅴ型膠原蛋白酰胺Ⅰ的波數在各月齡及不同部位骨骼肌之間無差異，均在波數1 630 cm-1處，說明在膠原蛋白的提取過程中采用胃蛋白酶處理，原蛋白的三螺旋結構沒有改變。酰胺Ⅱ的吸收峰均出現在波數1 560 cm-1處，正常情況下膠原蛋白酰胺Ⅱ的波數在1 550～1 600 cm-1范圍內[27]，主要來源于C-N伸縮振動和N-H彎曲振動，與酰胺Ⅰ帶相比，酰胺Ⅱ帶對膠原蛋白的二級結構不敏感[25]，12 月齡LD中有略微向低頻移動現象，但也在正常波數范圍內。酰胺Ⅲ帶是N-H彎曲振動引起的特征峰，屬于甘氨酸骨架和脯氨酸側鏈的CH2搖擺振動的體現[28]。各月齡Ⅴ型膠原蛋白的酰胺Ⅲ帶在波數1 300 cm-1處出現吸收峰。經傅里葉紅外光譜儀分析其二級結構發現，各月齡Ⅴ型膠原蛋白均出現了主要吸收峰，且峰形相似，吸收峰出現的波數有所不同。相對來講，ST波數與LD相比發生了微小的向低頻移動現象。ST酰胺A的波頻低于LD，這說明ST與LD相比有更多的N-H基團參與膠原蛋白分子內氫鍵的形成。
　　2.4 Ⅴ型膠原蛋白的熱變性溫度
　　膠原蛋白的熱變性溫度是指膠原蛋白在介質中受熱，到達一定溫度后，三螺旋結構發生解旋，各自形成單鏈，三螺旋解旋到50%時的溫度。由圖5～6可知，不同月齡烏珠穆沁羊骨骼肌肌肌內結締組織中Ⅴ型膠原蛋的DSC熱流分析曲線均出現了明顯的吸熱峰，為Ⅴ型膠原蛋白的熱變性溫度，其與膠原的被破壞程度有關[29]。
　　由圖7可知：烏珠穆沁羊ST肌內結締組織中Ⅴ型膠原蛋白的熱變性溫度隨著月齡的增長而升高，9 月齡和12 月齡之間沒有顯著差異（P>0.05），其他月齡間均有顯著差異（P<0.05）;LD肌內結締組織中Ⅴ型膠原蛋白的熱變性溫度隨著月齡的增長而顯著升高（P<0.05），但9 月齡和12 月齡及12 月齡和18 月齡間均無顯著差異（P>0.05）。這可能與膠原蛋白脯氨酸的羥基化程度和膠原蛋白共價交聯的數量和交聯的性質有關[30]。因此，同一月齡ST的熱變性溫度高于LD。
　　2.5 Ⅴ型膠原蛋白的氨基酸組成膠原蛋白的理化特性，特別是熱變性溫度與其氨基酸組成密切相關。由表2可知：ST內每100 mgⅤ型膠原蛋白樣品（干質量）的氨基酸含量分別為25.11、27.20、28.22、29.50 mg，隨著月齡的增長而增加，且各月齡間有顯著差異（P<0.05）;Ⅴ型膠原蛋白中甘氨酸含量較多，在膠原的螺旋結構中起著重要作用，約占氨基酸總量的20%，在6、9、12、18 月齡間，其含量隨著月齡的增加呈增加趨勢。膠原中脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）和羥脯氨酸（Hyp）含量較高，這是由于膠原（Gly-Pro-Hyp）n三重螺旋重復的特征性所致[31]。每100 mgⅤ型膠原蛋白樣品的亞氨基酸含量分別為4.71、5.12、5.18、5.66 mg，隨著月齡的增長而增長，且各月齡間有顯著差異（P<0.05）。丙氨酸、谷氨酸是Ⅴ型膠原蛋白的主要構成氨基酸，丙氨酸含量隨著月齡的增加而顯著增加（P<0.05），而谷氨酸含量隨著月齡的增長有上升的趨勢，12、18 月齡間差異不顯著（P>0.05），其他月齡間均有顯著差異（P<0.05）。然而，Ⅴ型膠原蛋白樣品的酪氨酸和蛋氨酸含量較低，只占總氨基酸含量的2%，檢出極少量的半胱氨酸。膠原蛋白亞氨基酸含量與膠原蛋白熱變性溫度有關，這一結果也證實了隨著月齡的增長骨骼肌肌內結締組織中Ⅴ型膠原蛋白的熱變性溫度增加這一結論。
　　研究表明，膠原蛋白亞氨基酸含量與膠原蛋白的熱變性溫度具有正相關性，羥脯氨酸含量越高，膠原蛋白的熱穩定性越高[32]。膠原蛋白亞氨基酸含量以及脯氨酸和賴氨酸的羥基化程度對膠原蛋白的熱變性起著重要的作用，主要原因是脯氨酸和羥脯氨酸含有的吡咯環限制性改變膠原蛋白多肽鏈的二級結構，吡咯環越多的膠原蛋白熱穩性越高[33]。對于LD肌內結締組織中的Ⅴ型膠原蛋白，其氨基酸總量為每100 mg Ⅴ型膠原蛋白樣品（干質量）中氨基酸總量分別為21.90、22.63、23.83、24.70 mg，隨著月齡增長而增加，且各月齡間差異顯著（P<0.05）;其甘氨酸隨著月齡的增長而增加，除了12 月齡和18 月齡無顯著差異（P>0.05）外，其他月齡間均差異顯著（P<0.05）;其亞氨基酸含量分別為5.27、5.29、5.71、5.89 mg/100 mg，隨著月齡的增長而增長，6 月齡和9 月齡、12 月齡和18 月齡間無顯著差異（P>0.05）。
　　對不同月齡肌內結締組織中Ⅴ型膠原蛋白的氨基酸組成進行分析發現，甘氨酸的含量占氨基酸總量的1/3左右，甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸的含量較高，蛋氨酸、酪氨酸的含量較低。氨基酸組成與Wang Lin等[34]的研究結果一致，其研究指出Ⅴ型膠原蛋白的谷氨酸、脯氨酸含量較高（每1 000 個氨基酸殘基中分別含有321.78、112.23 個殘基），酪氨酸和蛋氨酸含量較低（每1 000 個氨基酸殘基中分別含有2.35、6.69 個殘基）?？傮w來看，ST中的氨基酸含量略高于LD。 　　3 結 論
　　本研究通過酸溶、胃蛋白酶酶解和鹽析等方法，從烏珠穆沁羊骨骼肌肌內結締組織中提取出Ⅴ型膠原蛋白。SDS-PAGE結果顯示，所提取的Ⅴ型膠原蛋白均出現3 條肽鏈，推測其亞基組成為α1（Ⅴ）、α2（Ⅴ）、α3（Ⅴ）。傅里葉變換紅外光譜分析Ⅴ型膠原蛋白在酰胺A、B和酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶出現的特征吸收峰，結果表明，提取過程中膠原蛋白的三螺旋結構保持完整。烏珠穆沁羊骨骼肌肌內結締組織中Ⅴ型膠原蛋白含量隨著月齡的增長而增長，并且各月齡間有顯著差異（P<0.05）。不同月齡烏珠穆沁羊ST和LD肌內結締組織中Ⅴ型膠原蛋白的熱變性溫度隨著月齡的增長而升高。Ⅴ型膠原蛋白的總氨基酸含量、亞氨基酸含量、羥脯氨酸含量隨著月齡的增長而呈上升趨勢，且各月齡間有顯著差異（P<0.05）。ST中Ⅴ型膠原蛋白含量、熱變性溫度和氨基酸含量等均高于LD。
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