不同超聲功率處理對鰱魚肌原纖維蛋白理化特性及凝膠品質的影響

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　　摘 要：以鰱魚為原料，研究不同功率下超聲處理對鰱魚肌原纖維蛋白及其凝膠性質的影響。結果表明：隨著超聲功率的增加，肌原纖維蛋白起泡性、泡沫穩定性、乳化性和乳化穩定性均呈現先增加后降低的趨勢，超聲功率300 W時均達到最大值;肌原纖維蛋白熱凝膠的白度和持水性也隨著超聲功率的增大先增加后減小，在超聲功率300 W時達到最大值，較未處理樣品分別提高44%和27%;肌原纖維蛋白凝膠的蒸煮損失率呈現出隨著超聲功率的增加一直降低的趨勢，在超聲功率為400 W時達到最小值，較未處理樣品降低13%。上述結果表明，不同功率超聲波處理對鰱魚肌原纖維蛋白及其凝膠的改性具有一定的改善作用。
　　關鍵詞：超聲波;鰱魚;肌原纖維蛋白;凝膠
　　Abstract： The effects of ultrasonic power on physicochemical properties and gel properties of myofibrillar protein from silver carp were studied. The results showed that the foaming capacity， foam stability， emulsifying capacity and emulsion stability of myofibrillar protein first increased with increasing ultrasonic power up to 300 W and then decreased. The same trend was observed for whiteness and water-holding capacity （WHC） and their maximum values increased by 44% and 27% respectively compared with untreated samples. The cooking loss of heat-induced myofibrillar protein gel showed a gradually decreasing trend with ultrasonic power up to 400 W， and its minimum value was 13% lower than that of untreated samples. The above finding showed that ultrasonic treatment improved the properties of both myofibrillar protein and heat-induced gel from silver carp.
　　Keywords： ultrasonic; silver carp; myofibrillar protein; gelationDOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190121-017
　　中圖分類號：TS254.1                                  文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）03-0014-06
　　引文格式：
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　　鰱魚作為世界上淡水魚中撈捕量最大的10 種魚類之一[1]，具有高蛋白、低膽固醇、低脂肪、低熱、低鹽、口感鮮嫩、易于食用等特點[2]，但是由于鰱魚肉質單薄、魚刺較多的特點，其在市場上的銷量很低[3]。肌原纖維蛋白是鹽溶性蛋白，作為功能性蛋白成分被廣泛應用于食品工業中，而且是魚糜制品的功能成分，其結構與性質直接影響魚糜制品的形成，進而影響魚肉制品的品質[4]。近年來，魚糜制品越來越受到廣大消費者的喜愛，但淡水魚肌原纖維蛋白存在凝膠強度差、易發生冷凍變性等缺陷[5]，為了更好地開發利用淡水魚資源，將其肌原纖維蛋白改性，提高魚糜制品的凝膠品質是急需解決的問題[6]。目前，對肌原纖維蛋白改性的研究主要集中在pH值、提取方法以及添加糖、卡拉膠、谷氨酰胺轉氨酶（transglutaminase，TG）等化學改性對其功能性質的影響。Li Xingke等[7]研究發現，用脫乙酰度為77.3%的殼聚糖修飾鰱魚肌原纖維蛋白具有很好的改性效果;Chen Hongsheng等[8]研究發現，冷凍保護劑的加入使鯉魚魚糜肌原纖維蛋白熱穩定性、凝膠性得到提高。但上述研究具有低效率、耗時、耗能、成本高等缺點[9]。
　　目前在食品領域的研究中，超聲技術屬于十大高新技術手段之一[10]。超聲技術通過機械效應、空化效應、熱效應和化學效應作用于底物，使接觸它的物質反應快速而均勻，具有效率高、成本低、操作簡單、污染小等特點[11]。通過超聲技術處理過的肌原纖維蛋白，其分子質量不會發生任何改變，但是在超聲波的作用下，蛋白質的結構會發生一定的改變，蛋白質的結構是蛋白質體現功能性的基礎，因此改變蛋白質結構可以提高其功能特性[12]。張崟等[13]研究發現，超聲波處理提高了魚糜的凝膠強度、黏性、彈性和回復性等;McClements[14]研究表明，超聲波可以促進肌原纖維蛋白的釋放，進而提高肉制品的持水性、嫩度、黏結性等理化性質。然而，超聲波對肌原纖維蛋白理化特性的影響鮮有報道。利用超聲技術對蛋白質進行改性屬于用物理手段進行改性的一種方法，具有操作時間短、操作方法簡單、操作易于控制并且能耗較低等優點[11]。 　　本研究通過超聲方法在低溫條件下對鰱魚肌原纖維蛋白進行提取及改性，并探究不同超聲功率處理對肌原纖維蛋白的影響，通過掃描電鏡從微觀結構觀察不同超聲功率處理后鰱魚肌原纖維蛋白的結構變化。以期為通過超聲波改性鰱魚肌原纖維蛋白提供一定的理論基礎，為后續淡水魚的開發利用提供參考。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料與試劑
　　鰱魚購買于吉林農業大學校外農貿市場，將鮮活的鰱魚30 min內冰鮮送達實驗室。氫氧化鈉、氯化鈉 天津市津東天正精細化學試劑廠;鹽酸、硫酸、石油醚、無水乙醚 北京北化精細化學品有限責任公司;95%乙醇、無水乙醇、氯仿、正丁醇 天津市巴斯夫化工有限公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 天津市耀華化學試劑有限責任公司;以上化學試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水。
　　1.2 儀器與設備
　　JY98-IIIDN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;AvantiJ-26XP冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司;4K-15真空冷凍干燥機 美國Sigma公司;BSA-124S電子天平 德國賽多利斯集團;DHW-600電子恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司;EL20 pH計 瑞士梅特勒-托利多公司;IKA T10 basic高速分散均質機 德國IKA公司;TA.XT.Plus質構儀 英國Stable Micro System公司;TU-1901紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;Quanta 200F環境掃描電子顯微鏡 美國FEI公司。
　　1.3 方法
　　1.3.1 肌原纖維蛋白的提取
　　參照Liu Qian等[15]的方法，從鰱魚肌肉中提取肌原纖維蛋白。將從農貿市場買來的新鮮鰱魚30 min內運到實驗室，將其去頭、去尾、去鰭、去皮、去內臟、去紅色肉，取背部白色肌肉，將其絞碎，并加入4 倍體積的冰磷酸鹽緩沖溶液，勻漿60 s，在8 000 r/min條件下冷凍離心15 min，去掉上清液后取其沉淀，重復洗滌3 次后去掉上清液，再用4 倍體積0.1 mol/L的NaCl溶液洗滌3 次，4 ℃冰箱中恒溫放置，24 h內用完。肌原纖維蛋白的濃度采用雙縮脲法進行測定，以牛血清蛋白為標品[16]。
　　1.3.2 超聲波處理肌原纖維蛋白
　　將得到的肌原纖維蛋白溶液稀釋至40 mg/mL，取300 mL稀釋后的溶液于500 mL玻璃燒杯中，將燒杯（用冰水浴控制樣品溫度低于8 ℃）置于超聲波細胞破碎儀中，設置超聲功率為0、100、200、300、400 W，超聲時間設為30 min（工作時間和間歇時間分別為1 s和2 s），超聲處理后的樣品至于0～4 ℃冰箱內備用，24 h內用完[17]。
　　1.3.3 肌原纖維蛋白理化特性測定
　　1.3.3.1 起泡性和泡沫穩定性的測定
　　取5 mL質量濃度40 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液及10 mL蒸餾水于50 mL玻璃量筒內，體積記為V;9 500 r/min均質2 min，均質完后迅速讀取泡沫體積，記為V0;靜置30 min后，再次讀取泡沫的體積，記為V30。按照公式（1）～（2）計算樣品起泡性和氣泡穩定性[18]。
　　1.3.3.2 乳化性和乳化穩定性的測定
　　取質量濃度40 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液9 mL，加3 mL大豆色拉油，9 500 r/min均質1 min后分別在0 min和10 min時迅速從底部取出乳狀液100 μL，用0.1%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液（由pH 7.4、100 mmol/L的PBS配制而成）稀釋至5 mL，渦旋30 s，使其混合均勻，然后于500 nm波長處測定吸光度（A0）;并于10 min后，再次從底部吸取乳狀液100 μL，用0.1%的SDS溶液稀釋至5 mL，測定其吸光度（A10）[19]。按照公式（3）～（4）計算樣品乳化性和乳化穩定性。
　　式中：換算系數T=2.303;F為乳狀液中油體積分數（0.25）;t為時間/min，ρ為蛋白質質量濃度/（g/mL）。
　　1.3.4 肌原纖維蛋白熱凝膠的制備
　　將質量濃度40 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液溶解于0.02 mol/L、pH 6.5、含0.6 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液中，溶液轉移至25 mL燒杯中，每個燒杯中各25 mL;凝膠樣品的制備采用二步加熱法，即先40 ℃水浴加熱30 min，然后再90 ℃水浴加熱20 min，加熱完成后，凝膠樣品于冰水中冷卻，然后于4 ℃條件下平衡24 h，備用[20]。
　　1.3.5 不同超聲功率處理對鰱魚肌原纖維蛋白凝膠品質及微觀結構的影響
　　1.3.5.1 白度的測定
　　將樣品置于室溫下平衡，用色差儀的測試頭對準各樣品，分別測定0、90、180、270 °條件下的亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*），每組實驗重復測定3 次[21]。按照公式（5）計算白度。
　　1.3.5.2 保水性的測定
　　參考Kocher等[22]的方法。將處理好的凝膠在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，倒掉離心分離的液體，測定空離心管質量（m）、離心前離心管和凝膠總質量（m1）及離心去水后離心管和凝膠總質量（m2）。進行3 次平行測定，取平均值，按照公式（6）計算保水性。
　　1.3.5.3 蒸煮損失的測定
　　參照Jia Dan等[23]的方法，并稍作修改。將肌原纖維蛋白溶液質量濃度調整到40 mg/mL，肌原纖維蛋白溶液質量記為m1;隨后，將肌原纖維蛋白溶液倒入燒杯，按照1.3.4節描述的方法來制備凝膠，冷卻至4 ℃后，取出，擠出液體的質量記為m2。按照公式（7）計算蒸煮損失率。 　　1.3.5.4 環境掃描電鏡
　　將凝膠切成約2 mm×5 mm的薄片，用戊二醛（2.5%，pH 7.2）于4 ℃固定2 h，再用磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.2）洗滌;然后乙醇梯度（50%、60%、70%、80%、90%）脫水，各10 min;再用無水乙醇脫水3 次，各10 min;經過無水乙醇脫水后的凝膠樣品，再放在純叔丁醇中浸泡3 次，每次15 min;樣品用真空冷凍干燥機干燥后，采用Philips XL30型環境掃描電鏡觀察其微觀形態結構的變化[24]。
　　1.4 數據處理
　　每組實驗重復3 次，并計算平均值和標準差，表示實驗結果。實驗數據均采用Origin 7.5軟件作圖，運用SPSS 13.0軟件進行差異顯著性分析（P<0.05）。
　　2 結果與分析
　　2.1 超聲波功率對肌原纖維蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響
　　分布在蛋白質分子表面的極性基團和分子的大小與蛋白質的起泡性有關，分子質量越小，起泡能力越弱[25]。在超聲時間固定為10 min的情況下，由圖1可知：經過超聲波處理后的肌原纖維蛋白起泡性明顯高于未處理組，且起泡性隨著超聲功率的增加呈現先上升后下降的趨勢;超聲功率為300、400 W時，溶液的起泡性無顯著性差異（P>0.05），超聲功率為300 W時，溶液的起泡性達到最大值，為（56.80±2.25）%，相比未處理組提高44%。這是由于超聲波使肌原纖維蛋白變的分散，并且使折疊蛋白打開，導致疏水基團暴露，界面張力降低，因此提高了肌原纖維蛋白溶液的起泡能力。而超聲功率400 W時的起泡能力低于功率300 W時的原因是高強度的超聲功率作用下使空穴效應過強，產生的機械效應破壞了肌原纖維蛋白溶液的發泡體系，使分散的蛋白質再次聚集，將疏水基團藏于蛋白質內部，同時減弱了蛋白質多肽鏈之間的相互作用，降低了起泡能力[26]。
　　肌原纖維蛋白溶液的泡沫穩定性隨著超聲功率的增加呈現出先增加后降低的趨勢。超聲功率200、300 W時，溶液的泡沫穩定性無顯著性差異（P>0.05）;超聲功率300 W時，泡沫穩定性最高，比未處理組提高48%;而超聲功率超過300 W后，泡沫穩定性逐漸降低。當超聲功率增大時，蛋白質部分肽鏈在界面上伸展開來，促進了泡沫的形成和穩定;而當超聲功率繼續增加時，蛋白質分子之間相互作用形成的穩定網絡結構遭到破壞，泡沫界面膜破裂，導致泡沫穩定性降低[27]。
　　2.2 超聲波功率對肌原纖維蛋白乳化性和乳化穩定性的影響
　　蛋白質表面帶有的親水基團、疏水基團、電荷是表面活性物質，能夠在脂肪表面形成黏彈性膜，有利于水包油型乳狀液的形成[11]。由圖2可知：經過超聲波處理后的肌原纖維蛋白乳化性先增高后降低，但均高于未處理組，且差異顯著（P<0.05）;肌原纖維蛋白乳化性在超聲功率300 W時達到最大值，為（86.68±1.28） m2/g，比未處理樣品提高29%。乳化性升高可能是由于超聲處理使蛋白質變性，分子展開，內部疏水基團露出，疏水基團朝向脂質，極性基團朝向水相，形成油-水乳化液，對油滴再次集結形成一定阻力[11];而乳化性降低可能是由于持續的較高功率超聲波產生的高溫使蛋白質聚集或不溶，進而降低乳化性能[28]。
　　肌原纖維蛋白乳化穩定性在超聲功率200、300、400 W時無顯著性差異，在0～100 W內乳化穩定性升高，100～200 W穩定性下降，200～400 W時乳化穩定性變化不明顯。乳化穩定性升高可能是由于超聲波使蛋白質表面疏水基團暴露，表面疏水性增加，肌原纖維蛋白形成穩定的界面膜和網絡結構，界面吸附蛋白質濃度變大，界面張力減小，乳化穩定性增加[11];然而，隨著超聲功率的增加，吸附在膜界面上的蛋白質減少，界面張力增大，導致乳化穩定性降低。
　　2.3 超聲波功率對肌原纖維蛋白凝膠白度的影響
　　由圖3可知，肌原纖維蛋白凝膠白度隨著超聲功率的增加呈現先上升后下降的趨勢，在300 W時凝膠白度最大，為61.27±0.62，較未經超聲波處理的凝膠（42.42±1.14）提高44%。凝膠白度變大可能是由于超聲波處理使加熱后的肌原纖維蛋白形成結構更加致密均勻的凝膠，致密的結構使水分子更好地保存在其中，提高了凝膠的持水能力，使其具有更好的透明度。
　　Chen Hongsheng等[8]研究表明，肌原纖維蛋白凝膠的白度與蛋白質降解有關，肌原纖維蛋白發生了降解和非酶促反應，導致凝膠白度降低。而超聲波實際具有的殺菌作用能夠抑制蛋白質降解，在一定程度上有利于凝膠白度的改善[29]。
　　2.4 超聲波功率對肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響
　　肉的保水性（即持水性）是指肌肉在受外力作用時保持其原有水分與添加水分的能力，是蛋白質凝膠最重要的一個功能特性。適當的超聲波處理可使蛋白質溶解性增加，粒度變小，進而形成更加致密、均勻的網絡結構，提高凝膠的保水能力。
　　由圖4可知：超聲功率低于300 W時，隨著超聲功率的增大，熱處理形成的肌原纖維蛋白凝膠保水性呈現增加的趨勢，由（63.65±0.65）%增加至（81.20±0.99）%，提高27%;而當超聲功率過大時，超聲波處理產生的瞬間高溫使部分蛋白質變性，致密結構遭到破壞，不溶性蛋白變多，保水能力有所下降;當超聲功率達到400 W時，凝膠保水性降低至（77.93±0.43）%。
　　2.5 超聲波功率對肌原纖維蛋白凝膠蒸煮損失率的影響
　　蛋白質持水性代表蛋白質產品對水的吸附能力，是蛋白質凝膠最重要的一個功能特性。由圖5可知，超聲功率在400 W時，肌原纖維蛋白凝膠的蒸煮損失率達到最小值（44.54±0.72）%，較未經過超聲處理樣品的（51.77±0.62）%降低13%。這是由于超聲波處理改變了肌肉組織的微觀結構，使經過超聲波處理后的蛋白質疏水性殘基暴露，有利于熱凝膠網絡結構的形成，使其更加致密、均勻，提高了凝膠的保水性，進而降低了凝膠的蒸煮損失[30]。 　　2.6 不同超聲波功率處理肌原纖維蛋白凝膠的微觀結構
　　由圖6可知，采用掃描電鏡（2 000 倍）觀察發現，未經過超聲處理的肌原纖維蛋白凝膠表面孔洞粗大，空穴分布不均勻，與經過超聲處理后形成的凝膠形成明顯差別，經過超聲處理的凝膠表面更加平整致密，并且隨著超聲功率的增加，相比于圖B、C，圖D、E凝膠表面由粗糙變細致，不規則大小的空穴也逐漸形成小而均勻的孔洞。這種由不規則大孔逐漸變成緊致、細小孔洞的現象，可能是由于超聲波的空穴效應和機械效應使蛋白質粒徑減小所導致的[31]。同時，超聲波處理可使蛋白質疏水基團暴露，促進肌原纖維蛋白之間形成更加緊湊均勻的凝膠網絡結構。Zisu等[32]研究表明，超聲波處理后乳清蛋白凝膠強度的增加是蛋白質粒度的減小和致密均一的凝膠網絡結構形成的結果。
　　3 結 論
　　鰱魚肌原纖維蛋白溶液經過不同功率的超聲波處理后，隨著超聲功率的加大，起泡性、泡沫穩定性、乳化性及乳化穩定性均出現先上升后下降的趨勢。超聲功率為300 W時，溶液的起泡性達到最大值，為（56.80±2.25）%，比未處理組提高44%;溶液的泡沫穩定性在超聲功率為300 W時達到最大值，比未處理組提高48%;乳化性在超聲功率為300 W時達到最大值（86.68±1.28） m2/g，比未處理組提高29%;乳化穩定性在超聲功率為0～100 W內升高，100～200 W下降，200～400 W時變化不明顯。
　　鰱魚肌原纖維蛋白溶液經超聲處理后受熱形成凝膠，隨著超聲功率的加大，凝膠白度、保水性呈現先增大后減小的趨勢，凝膠蒸煮損失率一直呈現降低的趨勢。凝膠白度在超聲功率為300 W時呈現最大值，為61.27±0.62，較未處理組提高44%;凝膠保水性在超聲功率為300 W時達到最大值，較未處理組提高27%;凝膠蒸煮損失率在超聲功率為400 W時達到最小值（44.54±0.72）%，較未處理組降低13%。
　　凝膠環境掃描電鏡微觀結構圖可清楚顯示出，未經過超聲處理的肌原纖維蛋白凝膠與經過超聲處理后形成的凝膠有顯著差別，經過處理的凝膠表面更加平整致密，并且隨著超聲功率的增加，凝膠表面由粗糙、不規則大小空穴逐漸形成小而均勻的孔洞。
　　以上結果表明，不同功率超聲波處理對鰱魚肌原纖維蛋白及其凝膠的改性具有一定的改善作用。超聲波技術影響鰱魚肌原纖維蛋白高級結構的機理及在后期淡水魚產品開發中應用的改善效果還有待進一步研究。
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