膠原蛋白肽的制備

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　　摘要    為了獲取分子量較小、皮膚角質層易吸收的膠原蛋白肽，本文以新鮮豬皮為原料，用堿性蛋白酶水解方法制備膠原蛋白肽。結果表明，通過提取制備的豬皮膠原蛋白肽樣品顯示為淡黃色，而且豬皮的應用效率較高。
　　關鍵詞    豬皮;膠原蛋白肽;制備方法
　　中圖分類號    TS251.92        文獻標識碼    A        文章編號   1007-5739（2019）06-0220-01
　　豬皮，又名豬膚，東漢名醫張仲景在《傷寒論》中曾詳細記載了豬皮具有活血止血、補益精血、滋潤肌膚、光澤頭發、減少皺紋、延緩衰老的作用。豬皮中的蛋白質含量比較高，可以達到33%，其中膠原蛋白含量占總蛋白量的87.8%[1]。膠原蛋白由于特殊復雜的空間結構，其分子量高達300 kDa[2]，很難被機體吸收，通過蛋白酶水解可以將豬皮中的蛋白質水解為肽，其反應溫和，產品安全，適用于功能食品、化妝品及其他健康相關產品[3]。同時，膠原蛋白的化學組成、結構賦予了其獨特的生理活性，可發揮美白、保濕、防皺、修復、營養、減肥等美容美體作用[4]。膠原蛋白經水解后，其功能特性和生理活性功能將會被改善。膠原蛋白水解產物分子量的分布、疏水性的大小、極性的強弱等主要受水解過程的影響，從而影響膠原蛋白肽的活性功能[5]。研究表明，膠原蛋白肽的分子量一般在1～3 kDa時，其抗氧化活性、抑制皮膚黑色素生成、延緩皮膚老化和抑制紫外線損傷等功效是比較顯著的[6]。
　　我國豬皮生物資源極為豐富，本研究以新鮮豬皮為原料，采用堿性蛋白酶酶解法提取分子量相對較小、皮膚角質層易吸收的膠原蛋白肽，并驗證其對皮膚的美容保濕等功效。
　　1    材料與方法
　　1.1    試驗材料
　　豬皮，購于楊凌好又多雨潤專賣店。
　　1.2    試劑與儀器
　　試劑：堿性蛋白酶（8 500 u/g）為還原型谷胱甘肽，購于美國sigma公司;食用堿面（食品級）;三氯乙酸、氯化鈉，均為分析純。
　　儀器：UV-2450型紫外可見分光光度計（日本島津儀器有限公司）;RE-52AA型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）;SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）;H1650型離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）;HH-S4型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。
　　1.3    試驗方法
　　1.3.1    膠原蛋白肽的提取。提取流程：新鮮豬皮→剔脂→洗滌→切碎→回流→酶水解→滅酶活→離心分離→真空抽濾→蒸發濃縮→膠原蛋白肽濃縮液。具體操作步驟：①選取皮下脂肪含量少、皮質較透明的新鮮豬皮作為原料，將豬皮去污，刮去毛根，剔除皮下脂肪，切成3 mm×3 mm左右的小塊，用40 ℃的蒸餾水清洗2次。②將處理后的豬皮裝于錐形瓶中加入2%NaCl（豬皮與2% NaCl的質量體積比為1∶8），于常溫下放置8 h，取出豬皮中的雜蛋白。③按豬皮重量的7倍加入蒸餾水，升溫至100 ℃回流蒸煮1 h。④將回流后的豬皮加液體冷卻至55 ℃，加入0.2%食用堿面調節pH值為7.5，加入豬皮重量3%的堿性蛋白酶，放入恒溫水浴鍋中酶解12 h。⑤酶解完成后，將其放入95 ℃的恒溫水浴鍋中保持15 min以上，將酶滅活。⑥冷卻后，液體離心20 min 4 000 r/min，分離脂肪層及未酶解的豬皮。⑦將酶解液真空抽濾，用旋轉蒸發器50 ℃濃縮以得到豬皮膠原蛋白肽濃縮液，濃縮至原液體積的1/3。⑧將豬皮膠原蛋白肽濃縮液放于-20 ℃的冰箱中儲藏備用。
　　1.3.2    GSSH標準液的制備。稱取100 mg GSSH，用蒸餾水在100 mL容量瓶中溶解并定容至刻度。然后移取0、3、4、5、6、7、8 mL上述溶液于10 mL具塞試管中，分別用5%的TCA定容至刻度。此標準溶液的GSSH質量濃度分別是0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg/mL。
　　1.3.3    GSSH標準曲線的繪制。分別移取標準液6 mL于10 mL離心管中，再分別加入4 mL雙縮脲試劑，充分混勻。靜置20 min，2 000 r/min離心10 min，于540 nm下測定ABS值。
　　1.3.4    膠原蛋白肽含量的測定。取2.0 mL樣品溶液，加入等量10% TCA溶液，將其混合均勻（稀釋2倍），靜置10 min，4 000 r/min離心15 min，吸取上清液0.5 mL至10 mL容量瓶中，并用5% TCA定容至刻度（稀釋20倍），充分搖勻，然后取6.0 mL上述溶液于另一試管中（3次重復），加入雙縮脲試劑4.0 mL，混合均勻，靜置20 min，2 000 r/min離心10 min，在540 nm下測定ABS值，以GSSH質量濃度為0 mg/mL的處理作空白對照，對照GSSH質量濃度-ABS值標準曲線，求得樣品溶液中的多肽濃度，再乘以稀釋倍數（共稀釋40倍），即可求得樣品的多肽含量。
　　2    結果與分析
　　通過標準曲線法測定酶解液中肽的濃度，由圖1可知，其回歸方程為y=9.161 8x，相關系數R2=0.995 1。按上述方程計算豬皮酶解液中膠原蛋白肽的濃度為88.68 mg/mL。
　　3    結論
　　本試驗制得的豬皮膠原蛋白肽樣品為淡黃色，經堿性蛋白酶在55 ℃酶解12 h后，豬皮基本消失，豬皮的應用效率較高。通過GSSH曲線的繪制，測定豬皮酶解液中膠原蛋白肽的濃度為88.68 mg/mL。所制得的膠原蛋白肽樣品用三氯乙酸來沉淀蛋白，經離心，未發現蛋白沉淀，說明制得的膠原蛋白肽分子量相對較小，達到了本試驗對膠原蛋白肽的要求。
　　4    參考文獻
　　[1] 胥彩云，童軍茂，周曉宏.胰酶水解豬皮膠原蛋白及其產物氨基酸分析[J].食品研究與開發，2010，3l（9）：34-36.
　　[2] 臧盛，張立娟，盧進峰.豬皮膠原蛋白的研究進展[J].農產品加工，2011（11）：59-62.
　　[3] 李開雄，趙志遠，劉霞.豬皮中膠原蛋白的提取及其應用[J].肉類研究，1996（4）：43-48.
　　[4] 李國英.膠原、明膠和水解膠原蛋白的性能差異[J].四川大學學報（工程科學版），2005，37（4）：54-58.
　　[5] 馮成利，黨蕊葉，馮慧，等.胰蛋白酶水解鮮豬皮的條件選擇[J].陜西科技大學學報（自然科學版），2012，30（3）：23-25.
　　[6] 項智鋒，謝紅兵.不同酶法對豬皮中提取膠原蛋白的紫外線吸收對比分析[J].光譜實驗室，2008，25（6）：1249-1253.
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