斑馬魚作為肺癌模型的應用進展

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　　[摘要]肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率均居全球首位。因此，進一步了解肺癌發生發展的相關分子機制及致病機制，評價抗肺癌藥物的療效和安全性，對肺癌的診斷及治療都有重要意義，也為早日實現保障民生健康的改革發展理念添磚加瓦。斑馬魚是一種重要的模式生物，其基因與人類基因高度保守，生長速度快，最重要的是斑馬魚早期胚胎透明，有助于對發育過程進行實時觀測。在現代生物研究中，斑馬魚作為人類疾病模型得到充分的應用。本文主要闡述了斑馬魚在肺癌研究領域中的應用及研究進展，認為用斑馬魚構建肺癌模型技術已相當成熟。隨著實驗技術的不斷發展，其在肺癌相關研究領域的應用和發展將取得更大的進步。
　　[關鍵詞]綜述；肺癌；斑馬魚；模式生物；分子機制；抗癌藥物；進展
　　[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2019）5（b）-0025-04
　　[Abstract] Lung cancer is one of the most common human malignancy. Its morbidity and mortality are the highest in the world. Therefore， it is of great significance for the diagnosis and treatment of lung cancer to further understand the related molecular mechanisms and pathogenesis of lung cancer and evaluate the efficacy and safety of anti-lung cancer drugs. And also for the early realization of the countrys security health reform and development of the concept of the people′s livelihood. Zebrafish is a kind of important model organisms. Their genes with human genes are highly conserved， growth speed quick. The most important thing is that early embryonic Zebrafish transparent， which will help the development process for real-time observation. In modern biological research， Zebrafish as a model of human disease are fully applied. This article mainly elaborated the zebrafish in lung cancer research in the field of application and research progress. It′s thought that use Zebrafish lung cancer model construction technology already quite mature. With the continuous development of experimental technology， its application and development in the field of lung cancer related research will make greater progress.
　　[Key words] Review； Lung cancer； Zebrafish； Model organisms； Molecular mechanisms； Anticancer drugs； Progress
　　肺癌是目前全世界最常見的致死性腫瘤之一，死亡數約占所有癌癥死亡數的30%，中國每年有140萬人死于肺癌，每年新發肺癌患者大約有160萬人次[1]。根據組織病理分類，肺癌又可以分為小細胞肺癌（NSCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC），其中SCLC約占20%，NSCLC約占80%[2]。故加強對肺癌的研究仍然是當前保障民生的重要任務。目前對肺癌的治療，一般包括手術、放療、化療、內分泌治療、免疫治療、以及分子靶向治療等，其中肺癌的個體化治療是當下的一個熱門話題[3]，然而利用斑馬魚腫瘤模型可用于發現新的免疫檢查點，開發腫瘤新靶點、多靶點抗腫瘤藥，以達到對腫瘤患者個體化給藥；利用斑馬魚模型進一步研究腫瘤耐藥分子機制，為臨床合理調整腫瘤患者用藥提供理論依據。
　　1肺癌的分子機制
　　隨著科學技術的發展，研究者們已經開展了關于肺癌分子機制的各項研究，進一步揭開了肺癌發生發展的病理機制，從而為其治療水平提上了一個新臺階。
　　免疫治療成為當下肺癌治療的一個熱門話題，Mu等[4]研究發現，PD1及其配體PD-L1在NSCLC中極其普遍，PD1在NSCLC的腫瘤浸潤性T細胞中高表達，與腫瘤細胞高表達的PD-L1結合，傳遞負性調控信號，從而導致腫瘤抗原特異性T細胞的誘導凋亡和免疫無應答，使腫瘤細胞逃避機體的免疫監控和殺傷，PD1、PD-L1抑制劑的研究及應用為肺癌患者帶來福音。
　　PAQR又被稱為黃體酮和脂聯素（adipoq）受體家族，是一個高度保守的蛋白質家族，共有11個成員，即從PAQR1到PAQR11，其已被證實在多種腫瘤中作為腫瘤抑制因子，近來 Li等[5]研究發現，在NSCLC中，PAQR3在mRNA和蛋白水平均表達下調，其低表達在肺癌的發生發展中發揮重要作用。PAQR3過表達可顯著抑制NSCLC細胞G0/G1期增殖，并誘導細胞凋亡，促進細胞周期阻滯（P<0.05），研究還發現PAQR主要是通過PI3K/AKT通路抑制肺癌的發生。p53丟失以及Bcl/BclxL的過表達是腫瘤抗凋亡的主要分子機制，有研究指出，整合素a3和Bcl-2蛋白參與肺癌患者的預后。 　　Phiboonchaiyanan等[6]研究發現Phoyunnanin E通過活化caspase-3、-9和poly（adp-核糖）聚合酶切割，對H469肺癌細胞系有明顯的誘導凋亡作用，其主要是通過p53依賴性途徑來增加細胞p53蛋白的積累從而介導凋亡。并發現抗凋亡蛋白，如誘導的骨髓白血病細胞分化蛋白（MCL1）和B細胞淋巴瘤2（BCL2）顯著減少，而促凋亡的Bcl-2相關的X蛋白（BAX）被上調。
　　Yan等[7]研究發現高良姜素通過誘導Topoi構象重新的折疊，使α螺旋含量增加，而不利于其形成活性中心，進而導致Topoi活性的降低，從而對其有較好的抑制作用；研究發現高良姜素能夠優先結合到Topoi的活性中心附近，并與催化基MAr9364和lAsn352形成氫鍵，而使腫瘤細胞DNA單鏈解旋的速率降低，最終誘導肺癌腫瘤細胞株A549和H46的凋亡，進而達到抑癌作用。Yang等[8]的最近一項Meta分析的結果顯示，E-鈣粘素的表達下調和NSCLC發生發展有關，其可作為NSCLC患者的預后因子[8]。研究還發現E-鈣粘素不僅能直接調節細胞間的黏附作用，還能通過受體酪氨酸激酶產生調節表皮生長因子受體活性和影響GTP酶活性的8-連環蛋白在細胞內信號間接發揮功能。
　　2斑馬魚成為生物模型的優勢
　　利用斑馬魚做科學研究已有80多年的歷史。早在19世紀，斑馬魚發現于印度恒河流域，為淡水魚，屬脊椎動物亞門輻鰭魚綱鯉科[9]。早期，斑馬魚主要被用于胚胎發育和藥物處理研究。19世紀80年代，斑馬魚開始被應用于分子遺傳學研究，至此，斑馬魚作為生物模型的黃金時代拉開帷幕。
　　斑馬魚（Zebrafish）是近年來新興發展起來的用于研究脊椎動物腫瘤發病學和發育遺傳學的一種模式生物[10-11]。其作為一種新型的模式動物，以其獨特的優勢，已成為現代遺傳學、發育生物學等研究領域的重要模式生物[12]。斑馬魚作為生物模型具有如下優勢：①斑馬魚體型小，且為體外受精，受精卵發育迅速，受精后24 h即開始了器官發生，受精后5 d左右，其主要器官已發育完全，并執行相應功能；成年后，繁殖力強，產胚量多，且適合于實驗室飼養，這些都為斑馬魚成功加入到科學研究隊伍里提供了條件。②斑馬魚在幼魚階段適應性免疫功能不全，易于腫瘤異種移植[13]；斑馬魚腫瘤異種移植模型本身有極大的優勢，并且克服了小鼠的許多不足之處[14-15]。最重要的是其與人類的基因序列保持高度的相似性，約達87%，這些均為斑馬魚作為人類疾病模型奠定了重要的理論基礎。
　　作為研究腫瘤模型工具，斑馬魚被稱作是一種理想的脊椎動物模型。歸結原因如下：①從腫瘤的生物學角度來說，魚和人的腫瘤在組織學上是非常相似的。②魚的腫瘤竟然與人類一樣，也具有遺傳性。研究比較人和魚的基因序列，發現在細胞周期基因、腫瘤抑制因子、以及致癌基因等方面都具有保守性。③在藥物作用方面，發現雖然斑馬魚與人的蛋白同源性<70%，但蛋白功能域（如藥物作用的靶點）的同源性接近100%。④斑馬魚的胚胎和腫瘤具有相似的特征：比如細胞分裂快、細胞凋亡速度延緩和血管生成旺盛等。
　　綜上所述，斑馬魚作為腫瘤模式生物日益受到關注，目前其研究主要集中在腫瘤血管生成和細胞凋亡兩方面。
　　3斑馬魚所患的肺癌
　　盡管斑馬魚沒有肺器官，依靠魚鰓輔助呼吸。但先前有研究成功構建出斑馬魚胚胎移植乳腺癌，其也無乳腺組織，未做到組織器官發病，不過癌細胞在斑馬魚胚胎中的存活、促血管生成、遷移特征、及相關分子的表達都具有極高相似度；同時腫瘤標志物的相關因子如VEGF、HER2等重要靶點與人類有較高的保守性[16]，對于靶點藥物的評價也展示出了良好的適用性，在抗腫瘤的應用研究中得到很大認可。故研究者們開始大膽設想并進行研究，目前已經有關以斑馬魚為模型來研究抗肺癌藥物療效，如Vinothkumar等[17]的研究，說明以斑馬魚模型替代小鼠模型進一步驗證石墨烯對NSCLC有一定的抑癌作用，所以至此一大批以斑馬魚模型研究探究肺癌藥物的有效性和安全性的試驗將如雨后春筍般涌現，這也將進一步推動肺癌研究領域的快速發展。
　　4斑馬魚腫瘤模型建立技術
　　目前構建各種良、惡性腫瘤模型的方法包括基因突變、人類腫瘤細胞移植、直接致癌藥物干預等?？偨Y其腫瘤模型可分為以下3類：基因突變模型，化學誘導致癌模型，基因組改造模型[18]。由于斑馬魚與人類基因具有高度的同源性，各類腫瘤模型在組織學上與人類腫瘤是有高度一致性的。結合小分子篩選技術、遺傳分析和癌變檢測技術，斑馬魚正被廣泛用于新的腫瘤相關基因的發現及抗腫瘤藥物的篩選中[19-20]。斑馬魚的操作技術包括最常用的注射，其是在胚胎發育早期階段進行的；原位雜交技術是斑馬魚研究中最古老的方法之一；原位標記是斑馬魚研究中最經典的方式，是通過著色標記探針，用光學顯微鏡檢測信號；移植是發育生物學中應用得最古老的方法之一。在移植過程中，一團細胞從供體胚胎中移出，植入受體胚胎中；以及對基因表達下調、定向突變、轉基因工具和嵌合實驗。斑馬魚已經成為生物醫學研究中重要的體內模型，且已經開發和利用有效的方法來提供解決方案中的化合物或藥劑。最新研究表示，除了傳統的口服用藥和靜脈給藥，更推薦強飼，即一種灌胃程序，能更好的利于斑馬魚吸收，從而得出更精確的試驗數據[21]。這些技術的開發和應用都為斑馬魚在腫瘤模型及抗腫瘤新藥研究的發展打下堅實的基礎。
　　5斑馬魚肺癌模型的建立
　　許多研究者堅信斑馬魚能在科研道路上開辟出來一片新天地，一直倡導并致力借此研究腫瘤，現已卓有建樹。已有研究發現以成年斑馬魚為模式生物，對其進行肌肉注射5 μl的A549細胞，然后間隔14 d后，繼續注射。
　　5 μl的A549細胞。將魚置于21.l℃的水箱中，14/10 h的光周期和暗周期，如常喂養60 d，最后發展成腫瘤，但目前還沒有關于可用H60細胞系成功構建斑馬魚肺癌模型的研究[22]。 　　通過研究斑馬魚黑色素瘤模型，研究者們已經獲得多種治療人類相應癌癥的先導化合物[23]。有研究者以斑馬魚模型進一步探索肺癌細胞的侵襲和轉移能力及其發生發展的分子機制，如Eramo等[24]在NSCLC和SCLC中均發現了CD133腫瘤細胞，CD133是一種擁有極強的侵襲和轉移能力的肺癌腫瘤干細胞，其通過Notch及Wnt兩條通路來維持自我更新和無限增殖分化。相對來說，斑馬魚肺癌模型研究尚只應用于肺癌抗腫瘤藥物療效評價。勞喬聰等[25]借鑒斑馬魚腫瘤異種移植模型設計出斑馬魚肺癌異種移植模型，研究抗肺癌A549藥敏試驗中，藥效從高到低分別為貝伐單抗（65%）>順鉑（55%）>長春瑞濱（40%）>恩度（39%）>紫杉醇（27%）[26]。亦有研究者利用斑馬魚移植肺癌模型研究魚藤素的抑癌效果。
　　6小結
　　斑馬魚自身的眾多特點使其在生物模型中備受研究者們青睞，其移植瘤模型的制作方法簡便、重復性佳、周期且短，加之斑馬魚基因測序工程的完成，揭示其基因組與人類基因組的相似性高達87%[27]，在多種癌細胞的遷移研究和藥物活性評價方面具有獨特優勢。從目前的研究來看，隨著斑馬魚腫瘤模型的不斷深入研究，尤其是斑馬魚肺癌模型構建技術的不斷成熟，這將為肺癌的相關分子研究機制拉開新的研究途徑，同時也為接下來一大批肺癌耐藥機制的研究及新藥的研制提供更具優勢的生物工具，且斑馬魚在抗癌藥體內藥敏試驗方面具有獨特的優勢，可供研究者繼續挖掘。
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　?。ㄊ崭迦掌冢?018-10-30 本文編輯：崔建中）
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