產前診斷檢測技術的新進展

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　　 【摘要】 產前診斷是指對胎兒進行先天性缺陷和遺傳性疾病的診斷，是防控出生缺陷及提高人口素質的主要手段。產前診斷實驗室檢測方法多樣，從20世紀60年代的染色體核型分析發展到現在的基因測序技術，各種產前診斷實驗室檢測技術各有優缺點?，F就產前診斷實驗室檢測技術的進展及各產前診斷實驗室檢測技術的特點展開綜述。
　　 【關鍵詞】 產前診斷; 染色體核型分析; 基因測序
　　 doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.13.084 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2019）13-0-04
　　 近年來隨著高齡妊娠人數和環境污染的增加，出生缺陷的發生率在逐年上升。產前診斷可以有效地預防出生缺陷的發生，所以產前診斷越來越受到社會各界的重視。產前診斷技術是為了盡量控制出生缺陷，而通過各種方法檢測胎兒出生前患某種遺傳性疾病或先天畸形與否。產前診斷實驗室檢測技術主要包括：（1）染色體核型分析;（2）分子細胞遺傳學分析技術：熒光原位雜交（FISH）、微陣列芯片雜交技術等;（3）PCR;（4）多重連接依賴式探針擴增;（5）基因測序技術：一代測序、二代測序、三代測序、正在研究的四代測序技術等。各種產前診斷實驗室檢測技術各有優缺點，下面筆者逐一展開敘述。
　　1 染色體核型分析
　　 自20世紀60年代開始染色體核型分析技術已作為臨床上進行產前診斷染色體異常的金標準，常染色體核型分析技術在產前診斷中有G、Q、R、C、N等顯帶技術，可根據不同的需求來選擇。G帶帶型比較穩定，是最常使用的人類染色體核型分析檢測顯帶技術。目前鑒別G顯帶核型標準仍然是由人類細胞遺傳命名國際體系規定的，檢測的染色體是通過與其比對來判定改變與否。臨床上常見的遺傳病及染色體突變通過G顯帶核型分析技術來檢測準確可靠，該技術應用廣泛。為降低出生缺陷、提高出生人口素質，目前我國采用對所有孕婦進行早、中孕期的篩查，對篩查高危者再進行染色體核型分析產前診斷來進一步確診[1-3]。所以G顯帶核型分析技術對提高出生人口素質有重要的意義。G顯帶核型分析可檢測>5 Mb的染色體片段結構異常，且具有準確性高，經濟實惠等優點。但染色體核型分析無法檢測微小變異及缺失。
　　2 分子細胞遺傳學分析技術（包括FISH技術和微陣列芯片雜交技術）
　　 FISH技術是遵循堿基互補的原則，用標記后的DNA作探針，然后與載玻片上待測的DNA互補鏈進行雜交，然后檢測雜交位點熒光判讀染色體突變。FISH可直接檢測沒有經過細胞培養的標本是其最大的優點，最短可在1 h后直接給出診斷。FISH可避免污染，可分析間期細胞，因此其培養失敗率低及培養時間短，檢測時間亦縮短。FISH檢測已知染色體異常較染色體核型分析準確。FISH 技術應用于產前診斷不僅可以加快產前診斷的速度，而且準確性高[4-5]，還可以延長胎兒羊水染色體檢查在產前診斷中的時間窗。但FISH 因探針數目有限，只能對少數已知染色體異常進行診斷。
　　 微陣列芯片雜交技術是在全基因組范圍內檢測染色體的微缺失和微重復，且分辨率高的一種檢測技術。它由單核苷酸多態微陣列（SNParray）和比較基因組雜交微陣列（aCGH）組成。SNParray是在基因組水平上通過微陣列檢出單個核苷酸的變異的，aCGH 是通過微陣列檢出與疾病相關的染色體異常。微陣列芯片雜交技術與前述2個檢測技術相比具有通量高、分辨率高和自動化檢測高的優勢，可以一次性同時檢測許多與出生缺陷和先天性疾病相關的基因組異常，近年來已經廣泛應用于存在胎兒結構異常的侵入性產前診斷[6-7]。有學者證明了微陣列芯片雜交技術在檢測胎兒染色體重組方面的效率，它顯著提高了結構性缺陷胎兒的檢出率[8]。但微陣列芯片雜交技術只能檢測染色體數目重復或缺失，不能檢測染色體的結構異常，價格較昂貴。它的適應證是胎兒結構異常，且最好先行染色體核型分析檢查。
　　3 PCR技術
　　 PCR技術是針對人類染色體上具有多態性的短串聯重復序列而擴增的，檢測出常見的染色體數目異常的時間可短至幾小時內，其特點是快速、準確、成本低、敏感性高、特異性高等優點，但其即使結果正常也不能排除染色體畸形，且不能檢測染色體嵌合體及易位型，這些限制了其在產前診斷中的應用。但基因一代測序卻離不開PCR技術的輔助作用。
　　4 多重連接依賴式探針擴增技術
　　 多重連接依賴式探針擴增（MLPA）技術是基于 PCR 的一種檢測技術，可同時檢測多達50個DNA序列拷貝數的變化。是對DNA序列進行定性及半定量分析的方法，主要用于大缺失、重復的檢測，但無法同時針對整個外顯子的DNA序列進行檢測。故臨床上對明確致病基因的遺傳病可用MLPA技術進行產前診斷[9-10]。
　　5 基因測序技術
　　 基因測序技術是核酸DNA分子一級結構的測定。應用廣泛、發展迅速，已經從第一代發展到第四代。第一代測序技術測序準確性高，但通量較低，成本相對較高;第二代測序技術測序通量大大提高，是目前臨床上常用的基因測序方法;第三代測尚待完善;第四代測序技術還在實驗階段。
　　5.1 第一代測序（包括化學裂解法、Sanger測序）
　　 化學裂解法是基于PCR的DNA測序法進行的，其原理是：先處理有標記的DNA片段，然后特異性切割，并且產生降解產物，再經過電泳和放射自顯影之后可讀出相應片段DNA的核苷酸序列。此方法為最早的基因測序方法，但其操作復雜，且讀取片段短，目前很少應用。
　　 Sanger測序的原理是利用DNA聚合酶以待測單鏈DNA為模板，以dNTP為底物設立四種相互獨立的測序反應體系，給每個反應體系中加入不同ddNTP作為鏈延伸終止劑。雖然Sanger法的弊端有：離不開PCR擴增，只能分析單個DNA片段，通量小;自動化程度低，檢測速度慢;成本相對較高[11]。但Sanger測序準確性高，目前仍是基因分型的金標準。目前Sanger測序廣泛應用于全基因組測序及全外顯子測序的假陽性驗證方面。對已明確致病基因的遺傳性單基因疾病也可使用Sanger測序進行產前診斷[12-13]。 　　5.2 第二代測序
　　 第二代測序也叫高通量測序，其技術平臺包括三個，分別是：ABI公司的Solid測序平臺、羅氏公司454測序平臺、lllumina公司的Solexa測序平臺。三個測序平臺都有各自的優點，Solid測序平臺測序較準確，最大準確度可達99.94%;454測序平臺的測序讀長較長，可達400 bp;Solexa測序平臺性價比較高，運行成本低。第二代測序技術由于其通量大、可定量、成本低、邊合成邊測序的優點，其研究及應用越來越廣泛。二代測序技術已廣泛應用于無創產前診斷（NIPT）及有創產前診斷領域[14-16]。在器官移植配型、腫瘤分子診斷和靶向治療及在藥物個體化治療等方面的應用也成為熱點[17]。二代測序技術應用于全外顯子組測序、全基因組測序、基因組重測序、從頭測序、全轉錄組測序、小分子RNA測序等方面。其中應用最多的是全外顯子測序，下面筆者著重敘述全外顯子測序技術。
　　 于2009年在二代測序基礎上開發了全外顯子測序（WES）。WES是一種有選擇性地捕獲和排列所有帶注釋的蛋白質編碼基因編碼區域的技術。人類外顯子組序列僅占人類整個基因組序列的1%，卻有85%左右的人類致病突變包含在里面。WES的優點：WES覆蓋范圍廣;測序成本低;處理時間減少。然而WES也有局限性;某些蛋白質編碼區域可能不被覆蓋;WES沒有涵蓋潛在的功能性非編碼元素;WES檢測結構變化的能力有限。盡管如此，WES仍然是許多研究人員選擇的工具，到目前為止通過WES已成功發現了數百種遺傳病的致病基因[18-21]。全外顯子測序在一家族性房間隔缺損家系中檢測出TBX20（D176N）致病突變[22]。因WES技術在遺傳病中的廣泛應用，對有遺傳病家族史的孕婦行產前診斷提供很好的條件。麥明秦等[23]運用WES產前診斷ZMPSTE24基因突變。
　　5.3 第三代的測序
　　 第三代的測序技術也稱單分子測序技術。目前有2種，分別是利用合成測序理論測序的Helisope BioScience公司的SMS技術和以SMRT芯片為測序載體進行的邊合成邊測序技術的Pacific Bioscience的SMRT技術[11]。第三代測序為單分子測序，不需進行PCR擴增。第三代測序方法的優點為：（1）更高通量;（2）更短測序時間;（3）更長讀取長度;（4）更高精確性，可以檢測出極少的變異;（5）需要很少起始量;（6）更低的成本。當然其也有缺點：（1）很難保持酶的活性與穩定性;（2）很難在提高單分子信號靈敏度同時又不會把信號變成噪音增加熒光背景;（3）很難保持DNA的延展性而又不出現二聚體結構等。因為超長的讀取長度[24]，單分子測序技術前景廣闊，其可以在產前診斷中的應用被廣泛關注。2017年11月6日經濟日報刊登了一例第三代單分子基因測序儀成功應用于無創產前檢測（NIPT）的報道。第三代單分子基因檢測技術有望在不久后應用于產前診斷方面，在基因檢測領域發揮更大作用。
　　5.4 第四代測序
　　 第四代測序技術為納米孔測序技術，它改變了傳統的方法即序列讀取需要在復雜的酶促反應中進行，而是通過力學、電學等對DNA分子中的堿基直接判讀，但其尚處于研究當中。其中代表性的方法是Nanopores測序法，它是一種基于電信號測序的新型技術。第四代測序技術的優勢有：操作簡單、成本低、快速[25]。雖然目前第四代測序技術尚處于研究中，還不完善，但有望在不久的將來人們能利用其以最快的速度得到人類基因組信息，并期望其能用于產前診斷領域，為優生優育事業 做貢獻。
　　6 小結與展望
　　 綜上所述，產前診斷實驗室檢測技術發展迅速，科技的發展推動著產前診斷實驗室檢測技術的發展，產前診斷實驗室檢測技術已從20世紀60年代的染色體核型分析發展到現在的基因測序，是朝著更快速、準確、方便、經濟的方向發展。各種產前診斷實驗室檢測技術各有優缺點，各有其適用范圍。目前染色體核型分析仍然是產前診斷的金標準，當胎兒存在結構異常時可加做微陣列芯片雜交等，近年來基因測序技術發展迅速，其中二代測序近年來發展尤為迅速，其在遺傳性單基因疾病的產前診斷中的應用及植入前產前診斷的應用越來越被重視。產前診斷實驗室檢測技術的發展對防控出生缺陷及提高人口素質有重要意義。
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