MicroRNA-26a對人骨髓間充質干細胞成骨分化機制在修復骨缺損研究進展

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　　摘要：人骨髓間充質干細胞是人體成骨分化的主要骨母干細胞來源，主導人的骨與軟骨的再生與重建。近年在研究影響的影響因素上，microRNAs被報道其相關家族在骨髓間充質干細胞的分化過程中起著關鍵的調節控制作用，其中miRNA-26a在促進骨髓間充質干細胞成骨分化中起著關鍵作用。microRNA-26a通過影響Smad1、GSK3β、BMP、Id1信號通路增強骨髓間充質干細胞的成骨分化作用，從而促進骨質生成。本綜述將闡述microRNAs家族作用于成骨分化的發現，進一步詳細闡述microRNA-26a對人骨髓間充質干細胞的作用機制的研究發現和目前miRNA-26a轉染骨髓間充質干細胞對修復骨缺損的研究進展。
　　關鍵詞：microRNA-26a;人骨髓間充質干細胞;成骨分化;骨缺損
　　中圖分類號：R683                                  文獻標識碼：A                                   DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.06.015
　　文章編號：1006-1959（2019）06-0041-04
　　Abstract：Human bone marrow mesenchymal stem cells are the main source of osteoblasts for human osteogenic differentiation， leading to the regeneration and reconstruction of bone and cartilage.In recent years， influencing the influencing factors of microRNAs， microRNAs have been reported to play a key regulatory role in the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. miRNA-26a plays an important role in promoting osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.microRNA-26a enhances osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by affecting Smad1， GSK3β， BMP， and Id1 signaling pathways.This review will describe the discovery of microRNAs family acting on osteogenic differentiation，the research on the mechanism of microRNA-26a on human bone marrow mesenchymal stem cells was further elaborated and the research progress of miRNA-26a transfected bone marrow mesenchymal stem cells on repairing bone defects.
　　Key words：microRNA-26a;Human bone marrow mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation;Bone defect
　　骨缺損（bone defect）是指骨的完整性受到破壞，病因常見于創傷、感染、腫瘤、骨髓炎手術清創、以及各種先天性疾病。骨缺損的形成使得肢體正常生物力學結構喪失，對患肢的正常生理功能構成障礙。骨折斷端骨質的大規模缺損，導致骨折斷端不能正常愈合，稱為骨缺損性骨不連。骨不連是骨科難題的同時也影響著患者的生活質量。目前治療骨缺損主要方式有：①骨移植技術：通過在骨缺損部位移植異體骨、或自體骨的手術治療方式，促進骨質的生長，但存在異體免疫排斥、感染、對自身取骨區造成骨質破壞等缺點。②骨搬運技術：利用Ilizarov外固定支架，基于基本原理是張力-應力法則（law of tension stress，LTS），即活的生物組織在持續、穩定、緩慢牽拉下能刺激細胞分裂，組織再生和活躍生長[1]。還有髓內釘技術、鋼板內固定技術等，以上技術都存在各自的優缺點，未能對治療骨不連得出比較確切的治療方式。人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）是屬于多能干細胞，在骨科領域，microRNAs主要應用于體外誘導骨髓間充質干細胞的成骨分化實驗，例如：間充質干細胞（MSCs）外含小體在動物軟骨缺損區域具有顯著的調節促進軟骨再生作用[2]。在用生物功能支架結合轉染促進間充質干細胞的miRNAs成骨誘導研究中，Deng Y等發現[3]，當miRNA-31的過表達時，能夠有效抑制成骨因子（Satb2、Osx和Ocn）。反之，當miRNA-31敲除表達后，脂肪干細胞的骨誘導分化將會大大的增強，使含抑制miRNA-31的ASCs材料用于骨誘導再生形成和修復骨缺損在治療上是存在可行性的，開辟了治療骨缺損基因層面的新治療方式。近年相關研究表明[4，5]，miRNAs調控骨髓間充質干細胞成骨分化，其中miRNA-26a對骨髓間充質干細胞成骨分化起正向調控作用。但是，人骨髓間充質干細胞成骨分化與microRNA-26a之間的分子信號通路機制目前研究尚未明確，microRNA-26a對骨髓間充質干細胞的成骨分化機制的進一步研究，對修復骨缺損的基因治療層面上具有重要意義。本文綜述microRNAs家族作用于成骨分化的發現，進一步詳細闡述microRNA-26a對人骨髓間充質干細胞的作用機制的研究發現和目前miRNA-26a轉染骨髓間充質干細胞對修復骨缺損的研究進展。 　　1 microRNAs在生物體內生理意義
　　microRNAs是一類非編碼小RNA，在生物體內DNA轉錄后水平的基因調控中起重要作用。對生物體內的組織再生、干細胞性能分化上具有重要調控作用，可以激發細胞內修復機制或通過引導細胞分化導向作用，來達到目標蛋白的表達，所以microRNAs作用于組織定向分化再生的治療方法有可能實現[4]。microRNAs普遍存在于生物體內各個角落，對不同的組織分化均有不同的調控作用。近年關于microRNAs對于骨髓間充質干細胞分化研究表明，不同的miRNAs在誘導骨髓間充質干細胞的成骨分化的信號通路機制是不同的。例如，microRNA-26a通過靶向抑制TOB1蛋白的表達，來促進骨髓間充干細胞的成骨分化作用[5]、microRNA-29b通過下調成骨分化抑制劑，HDAC4，TDFb3，ACVR2A等促進小鼠前成骨細胞MC3T3-E1細胞中的成骨分化[6]、microRNA-2861、microRNA-3960分別靶向Hoxa2和HDAC，進一步增加了Runx2促進成骨分化的表達[7]。上述部分microRNAs中在生物體內通過不同的作用方式促進骨髓間充質干細胞成骨分化的過程。相反，microRNA-204、microRNA-211、microRNA-133、microRNA-135、microRNA-125b、microRNA-206分別通過下調RUX2、BMP-2的表達抑制堿性磷酸酶（ALP）和骨鈣素（OCN）的生成，來抑制成骨細胞的分化以及骨的再生[8]。在microRNAs調控體內干細胞的成骨分化實驗室數據支持下，使microRNAs在成骨分化過程中擔任著重要角色。
　　2 microRNA-26a的體內調控作用
　　microRNA-26a作為microRNAs家族中的一員，其在誘導骨髓間充質干細胞的成骨分化作用的重要性，得到越來越多的研究者的論證支持，逐漸成為誘導骨髓間充質干細胞成骨分化研究上的熱點對象之一。在篩選具備成骨分化作用的microRNA的比較中，例如：microRNA-26a，microRNA-29b，microRNA-2861，microRNA-27，microRNA-29a，microRNA-218[5，6，10-12]均具有促進骨髓間充質干細胞成骨分化的作用。實驗數據表明，在OVX組（卵巢切除術小鼠組）中microRNA-26a表達顯著降低（P<0.01），證明microRNA-26a在骨質疏松模型中具有增強成骨分化的作用，并且microRNA-26a被確認為靶點microRNA[5]。在后續的研究中，證實microRNA-26a通過下調SMAD1蛋白的表達，來促進hADSCs的成骨分化作用的分子機制[12]。實驗數據表明，得出microRNA-26a與menin在SMAD1的microRNA調節中的相互作用，進一步作用于骨髓間充質干細胞早期成骨分化的調節[13]。在骨周圍的軟組織調節角色上，microRNA-26a能通過直接調節TGF-b信號級聯反應，對血管平滑肌（SMC）的增殖、遷移、凋亡進行調控，對受損的血管修復的過程發揮癥重要的調節作用[14]。在進一步的實驗數據支持，microRNA-26a可通過抑制內皮SMAD1的表達，并通過BMP/SMAD1/Id1信號通路調節血管的生成作用[15]。為此可以證實，miRNA-26a在調節機體內人脂肪干細胞成骨、平滑肌、血管調控分化中起到關鍵調控開關作用，同時microRNA-26a對血管、平滑肌細胞誘導分化均為骨髓間充質干細胞分化形成骨基質奠定重要前提條件。從上述研究中可以得出，microRNA-26a在誘導干細胞成骨分化的最終目的上，并非單一促進骨髓間充質干細胞的成骨分化，會同時在體內兼顧完善骨髓間充質干細胞分化成骨的前提形成條件，構建局部整體適合干細胞成骨分化的微環境體系。
　　3 microRNA-26a在人骨髓間充質干細胞成骨分化的分子機制
　　microRNA-26a是已確定為骨形成調節劑的幾種microRNAs之中重要的一種，microRNA-26a通過抑制Smad1和GSK3β蛋白的表達來增強骨髓間充質干細胞的成骨分化作用[16]。在對microRNA-26a對GSK3β蛋白的分子機制研究上發現，microRNA-26a通過直接結合mRNA的3'UTR而干擾GSK3β，通過抑制GSK3β蛋白的表達來增強hADSCs中的成骨細胞活性[17]。在RANKL介導的破骨細胞形成中，microRNA-26a通過抑制CTGF在破骨細胞形成中起負調節劑作用，抑制破骨細胞的生成[18]。上述實驗還顯示，GSK3β通過調節β-連環蛋白影響Wnt信號傳導途徑，隨后改變下游靶C/EBPα的表達，發現C/EBPα通過與CTDSPL啟動子區域物理結合而轉錄激活microRNA-26a的表達（圖1）[17]。
　　MicroRNA-26a對人骨髓間充質干細胞正向成骨分化的促進作用，得到后續實驗室數據上的論證支持。 對于microRNA-26a在目前可能性的信號通路，例如Smad1、GSK3β、BMP、Id1信號通路，具體microRNA-26a是通過哪一種信號機制作為主導控制作用，還是多種信號通路共同協同作用控制骨髓間充質干細胞的成骨分化過程，有待進一步探討。對microRNAs與骨髓間充質干細胞的成骨誘導分化的信號通路的闡述明確，有助于研制能夠強化microRNAs促進干細胞正向成骨分化的激活因子，有助于促進干細胞的成骨分化，為解決目前臨床上骨缺損治療方案提供一種可行有效的治療方案。
　　4骨髓間充質干細胞轉染microRNA-26a生物支架在修復骨缺損的研究現狀
　　骨缺損是由于創傷、腫瘤、感染等多種病因所致的骨質缺失，使正常骨的完整性與連續性受破壞，影響骨骼的正常生理、物理功能，導致患肢骨折斷端長期不愈合、不能正?；顒迂撝?，占據了高醫療費用、并嚴重影響患者的社會、生理功能。為了能夠有效解決臨床骨缺損這一難題，以目前主流骨移植技術、骨搬運技術都未能較好的解決這一問題，而microRNA-26a轉染骨髓間充質干細胞（BMSCs）促進成骨分化的研究出現，為未來解決骨缺損的難題，開辟了廣闊可行的前景大道。以接近人骨鈣磷比例構建羥基磷灰石（HA）生物支架，在支架上附著予microRNA-26a轉染完畢的骨髓間充質干細胞植入小鼠骨缺損模型中，實驗數據表明[19]，microRNA-26a可顯著提高骨髓間充質干細胞的成骨分化能力，并在體外未見明顯的細胞毒性，因此microRNA-26a轉染的骨髓間充質干細胞與HA支架的組合可顯著改善新骨的分化形成，可作為修復骨缺損的骨替代物。而在以明膠構建的生物功能支架與磷灰石包被的聚乳酸羥基乙酸（PLGA）功能支架比較上，明膠構建的生物功能支架對表達BMP2的ASCs能使體內有效的軟骨形成并完成臨界尺寸的小鼠顱骨骨缺損的骨愈合，而在磷灰石包被的PLGA功能支架與表達BMP2的ASCs構建體，小鼠骨缺損骨性愈合程度顯著弱于前者[20]。通過計算機預測篩選與血管生成相關的microRNA-21，microRNA-29b，microRNA-26a在骨髓間充質干細胞的增殖表達檢測表明，microRNA-26a在骨髓間充質干細胞中的表達水平是其余兩者的6倍，使得血管生成因子Vegf分泌增加，對血管生成具有明顯的促進作用[21]。而microRNA-26A轉染的骨髓間充質干細胞在水凝膠和化學修飾構成的系統中，表現出顯著的血管生成和骨形成效應[21]。以上的實驗引發一個值得思考的問題：在microRNA-26a轉染的骨髓間充質干細胞的體系基于何種生物材料的功能支架，才能使得該構建體系擁有最大成骨療效。研究表明，以具備桿狀病毒凝膠包裹的PLGA支架較普通支架對轉染目標microRNA至骨髓間充質干細胞內表達效率高達于常規無病毒載體的普通支架，同時表明通過桿狀病毒介導的microRNA-26a、microRNA-29b、microRNA-148b、microRNA-196a的表達具有促進骨髓間充質干細胞成骨分化的作用[22]。在非病毒介導合成的HP聚合物構建“雙殼”凝膠結構的microRNA-26a功能PLLA支架，避免了病毒介導所帶來的免疫應答反應，能夠分步傳送目標microRNA至骨髓干細胞內，有效提高microRNA-26a的轉染率和在骨髓間充質干細胞中的表達，發現microRNA-26a的成骨作用是通過功能靶向Gsk-3b來增加Ob的活性而不是抑制破骨細胞的活性，刺激骨髓間充質干細胞的成骨分化[23]。在上述的實驗中，microRNA-26a在不同的生物功能支架上，都表明對轉染的骨髓間充質干細胞的成骨分化作用具有促進作用。而在于比較哪種類型的生物功能支架更加適應microRNA-26a在體內持續高效轉染并表達其生物功能作用，目前需要進一步的研究與探討。 　　5總結與展望
　　本文概述了目前治療骨缺損的現狀和目前治療方式上的優缺點。近年microRNAs家族的生理意義研究發現，microRNA-26a可通過Smad1、GSK3β、BMP、Id1信號通路或其他未明確的信號通路，對骨骼肌周圍血管的再生和骨髓干細胞的成骨分化起到正向調控作用。這一發現，讓microRNAs應用于治療骨缺損的臨床治療上奠定了理論基礎。進一步實驗研究表明microRNA-26a轉染骨髓間充質干細胞生物功能支架的類型及在小鼠顱骨骨缺損模型中的成骨分化上的研究：不同的生物功能支架，其負載的microRNA-26a對骨髓間充質干細胞的轉染率與促進成骨分化的效率程度均存在對小鼠骨缺損節段具有存進成骨分化作用。microRNA-26a對骨髓間充質干細胞成骨分化促進作用，為解決目前骨缺損狀況提供了一個可以探索的途徑，但microRNA-26a能否與其他microRNAs家族成員相互協同調控Smad1、GSK3β、BMP、Id1信號通路或其他為明確的信號通路調控骨髓間充質干細胞的成骨分化作用暫未有科學的結論。另外，microRNA-26a轉染骨髓間充質干細胞生物功能支架促進成骨分化修復骨缺損的結論是通過動物實驗證實的，尚未有相關microRNAs轉染骨髓間充質干細胞生物功能支架應用于臨床人體中，microRNAs-骨髓干細胞生物支架是否對人體具有特異性及副作用仍然未知。因此，microRNA-26a轉染骨髓間充質干細胞生物功能支架促進成骨分化修復骨缺損的靶向治療方式仍需更多的實驗研究進一步探索。
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　　收稿日期：2018-12-19;修回日期：2019-1-5
　　編輯/楊倩
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