干細胞在皮膚創面修復應用中的研究進展

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　　[摘要]創面修復是皮膚科和整形外科常見的臨床問題，干細胞具有自我更新以及多向分化潛能，近年來，在皮膚創面修復領域受到廣泛關注。通過將干細胞與促進細胞增殖的細胞因子聯合使用，或利用基因工程技術以及使用干細胞制作組織工程皮膚等新技術，不僅豐富了干細胞的治療手段，而且提升了干細胞修復創面的能力。該文對近年表皮干細胞、間充質干細胞、毛囊干細胞及間充質干細胞外囊泡在皮膚創面修復領域的相關研究進展綜述如下。
　　[關鍵詞]干細胞;皮膚;再生;組織工程;創面修復
　　[中圖分類號]R322.99     [文獻標志碼]A   [文章編號]1008-6455（2019）06-0159-05
　　Abstract： Wound repair is a common clinical problem in dermatology and orthopedics. The stem cells have self-renewal and multi-directional differentiation potential，and have received widely attention in the field of skin wound repair in recent years. The combination of stem cells with cytokines， or the use of genetic engineering techniques and tissue-engineered skin not only enrich the treatment of stem cells， but also enhance the ability of stem cells to repair wounds. In this paper， the research progress of epidermal stem cells， mesenchymal stem cells， hair follicle stem cells and mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in the field of skin wound repair has been reviewed.
　　Key words： stem cell; skin; regeneration; tissue engineering; wound repair
　　干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞，成體干細胞同樣具有較強的多向分化潛能，在一定條件下可以分化為骨、肌肉、脂肪、血管、肝臟、神經及上皮等多種組織細胞[1]。目前，對干細胞在創面修復中研究較多的有表皮干細胞、間充質干細胞及毛囊干細胞等，本文就干細胞在創面修復中的相關研究進展綜述如下。
　　1  表皮干細胞（Epidermal Stem Cellls， ESC）
　　表皮干細胞來源于胚胎的外胚層，是各種表皮細胞的祖細胞，在特定微環境下還可被誘導分化成皮膚附屬器。表皮干細胞位于表皮基底層，具有慢周期性、自我更新增殖能力及對基底膜黏附的特點。隨著年齡的增長，表皮的彈性、厚度、增殖及免疫等在一定程度上受到影響，但表皮干細胞的數目、功能、基因表達和分化反應性等始終保持穩定的水平。肖靜等[2]采用溴脫氧尿嘧啶核苷（Bromodeoxy Uridine，Brd U）標記追蹤ESCs，發現在創面修復過程中，ESCs能夠通過向創緣遷移并增殖，主動參與創面的修復，是創面上皮化的重要來源。
　　糖尿病創面難以愈合的原因之一是糖尿病高糖狀態通過抑制磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidyl Inositol 3-Kinase，PI3K）的磷酸化而使ClC-2型氯通道（簡稱ClC-2）的表達下降，進而抑制了ESC的遷移能力[3]。常飛等[4]發現局部單用神經生長因子或胰島素治療糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創面，可使表皮中ESCs增多，提高創面愈合率，而神經生長因子和胰島素聯合組表皮中ESCs的表達較單用組高，創面中皮島出現早而且數量多，創面愈合率亦明顯升高，這為ESC在糖尿病創面的應用提供了理論依據。Zhao[5]研究發現細胞周期蛋白D1過表達誘導分化的表皮細胞，具有表皮干細胞的形態學、表型和功能特征，可以加速實驗動物傷口愈合。這提供了一種新方法來產生用于傷口修復和再生的表皮干細胞。
　　在孕中期胎兒的全層皮膚缺損創面，主要以完全再生的方式進行修復，成人皮膚創面主要以瘢痕方式愈合。主要調控動物發育的同源異形框基因族（Paired-Related homeobox gene，PRX），尤其是PRX-2基因在胎兒皮膚中的表達水平遠高于成人，而胎兒或成人皮膚ESCs主要分布的區域正是PRX-2基因陽性表達的位置。王統民[6]發現PRX-2基因過表達的成人ESCs，PRX-2蛋白表達上調，ESCs增殖速度增加，而PRX-2基因沉默的胎兒ESCs，PRX-2蛋白表達下調，ESCs增殖速度顯著降低。何秀葉等[7]使用過表達PRX-2基因的ESCs制作的組織工程皮膚修復裸鼠全層皮膚缺損創面，見膠原生成較多，排列較規則，肉芽組織生長良好，并有部分皮膚附件產生，創面愈合情況較對照組好。代濤等[8]采用自體表皮干細胞膜片修復巨痣切削術后創面缺損10例，對照組行自體刃厚皮片移植。實驗組創面愈合時間比對照組明顯縮短，隨訪發現在瘢痕增生或攣縮、皮膚色澤及彈性等皮膚功能方面表現良好。綜上，ESCs對維持表皮的自我更新和增殖潛能、保持皮膚的正常結構起著重要作用，而且PRX-2可促進ESCs的增殖，為ESCs的研究應用提供了新思路。
　　2  間充質干細胞（ Mesenchymal Stem Cells， MSCs） 　　間充質干細胞來源于發育早期的中胚層，取材方便，容易擴增，免疫源性低。當組織血管化受損時，間充質干細胞通過分泌基質細胞衍生因子-1（Stromal cell-Derived Factor-1，SDF-1）、血管內皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor， VEGF）、胰島素樣生長因子、表皮生長因子（Epidermal Growth Factor， EGF）、干細胞因子等多種細胞因子刺激內皮祖細胞的動員、擴增以及分化，促進干細胞分裂，血管新生、組織再生及減弱瘢痕形成，而促進創傷愈合[9]。
　　2.1 骨髓間充質干細胞（Bone Mesenchymal Stem Cells， BMSCs）：BMSCs最早于1968年，由Friedenstein等培養全骨髓細胞時發現，能分化為多種間充質組織。SDF-1及其膜受體CXC趨化因子受體4型（CXC Chemokine Receptor4，CXCR4）參與多種干細胞的歸巢和遷移、細胞增殖和血管生成。SDF-1是唯一能與CXCR4結合并激活的天然趨化因子。在創傷愈合過程中，SDF-1/CXCR4信號軸誘導MSCs遷移到創傷部位，并誘導其分泌VEGF、促纖維生長因子和TGF-β等多種生長因子，形成許多血管網，參與傷口修復，過表達CXCR4的BMSCs遷移能力增強，可加速傷口愈合[10]，而阻斷CXCR4會減弱BMSCs遷移能力。BMSCs可以提高糖尿病大鼠足潰瘍創面VEGF水平和小血管數目來加速創面愈合，BMSCs復合EGF還可促進大鼠β射線皮膚損傷創面的愈合[11-12]。池凱等[13]發現用BMSCs和脫細胞真皮基質（Acellular Dermal Matrix，ADM）構建組織工程皮膚對小鼠背部全層皮膚缺損創面具有很好的促愈合作用。王琦等[14]使用BMSCs聯合微粒皮或自體小皮片移植治療豬全層皮膚缺損，BMSCs能促進移植創面的微粒皮、小皮片組織成活，調節TGF-β1和TGF-β3的表達，促進創面愈合。BMSCs加微粒皮或自體小皮片組，Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達高于單用BMSCs組，提示單純骨髓間充質干細胞治療還不能取代傳統的微粒皮和小皮片植皮。
　　2.1.1 BMSCs標記和監測技術：昕桐等[15]發現超順磁性氧化鐵納米顆粒標記后的BMSCs在磁場作用下，能向創面聚集并促進創面愈合。這種磁性顆粒具有超順磁性、低毒性、良好生物相容性及在外加磁場下定向移動等特點，在細胞標記、藥物靶向投遞及腫瘤治療等方面都有廣泛應用[16]。Oh EJ等[17]用表達螢火蟲熒光素酶（Firefly Luciferase，FLuc）的MSCs靜脈注射到燒傷小鼠，結果顯示MSC可以促進傷口愈合，而且利用Fluc基因的光學成像可以非侵襲性地在動物模型中監測MSC遷移到燒傷部位。Chu[18]將綠色螢光蛋白標記的BMSCs與從正常小鼠ADM支架共培養后，移植到糖尿病小鼠的全層皮膚傷口，采用多光子顯微鏡同時采集I型膠原纖維的光學二次諧波圖像和熒光化合物的雙光子激發熒光圖像，以監測和評估傷口愈合。結果發現局部移植MSC-ADM可有效促進糖尿病皮膚創面的愈合，促進血管生成和快速再上皮化。多光子顯微鏡是一種無創的三維結構成像方法，為研究干細胞的功能監測提供了更為便利的手段。
　　2.1.2 BMSCs修復能力的提升：干細胞移植治療技術在臨床應用過程中仍然存在許多缺陷和不足，其最關鍵問題是分離培養的干細胞在體外會遭遇多次氧化應激損傷。研究發現用低濃度H2O2（50μmol/L）預處理BMSCs，通過PI3K/Akt/mTOR信號通路發揮抗凋亡活性，能顯著增強BMSCs抗氧化應激損傷能力，將低濃度H2O2預處理的干細胞移植治療創面，能增強其在創面的生存能力，并能顯示出更佳的促愈效果[19]。此外，移植BMSCs的存活能力差，分化成所需細胞類型的能力有限，常常阻礙其應用。Shou等[20]利用甲殼素納米纖維（Chitin nanofiber，CNF）水凝膠在體外誘導BMSCs分化，可降低BMSCs轉錄因子（Oct4和Klf4）的表達，誘導其分化為創傷再生所必需的血管生成細胞和成纖維細胞。在體內，用BMSCs水凝膠處理的大鼠全層皮膚傷口比局部注射BMSCs的傷口顯示出更好的細胞活性，促進肉芽組織形成，加速創傷修復。CNF水凝膠不僅提高了外源性BMSCs的存活能力，而且提供一種能夠增強BMSCs再生潛力以促進傷口愈合的功能支架。這可能有助于克服目前在創傷再生領域所面臨的干細胞治療的局限性。
　　通過藥物的預刺激也能提升BMSCs的修復能力。Yang Z等[21]使用姜黃素預處理BMSCs移植治療皮膚創傷，結果顯示姜黃素能促進BMSCs的增殖，改變纖維連接蛋白和Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量和比例，表皮厚度和膠原沉積更接近正常皮膚，此外姜黃素還能產生大量SDF-1，促進大量白細胞遷移，調控TH1細胞和M1巨噬細胞而創造良好的免疫微環境。雞胚提取物（Chicken embryo extract，CEE）是許多刺激細胞增殖的生長因子的豐富來源，BMSCs和CEE單獨或聯合應用于隨機皮瓣大鼠模型，對皮瓣存活率和血管數量都有促進作用，而BMSCs治療產生的肥大細胞對缺血組織模型中的皮瓣存活具有抑制作用[22]。因此，在BMSCs治療缺血性皮瓣的研究中，應該使用肥大細胞穩定劑和分析肥大細胞顆粒，以找到更有效的給藥途徑。
　　2.1.3 BMSCs臨床應用：鄧利娟等[23]在擴血管、抗感染及營養末梢神經等常規治療基礎上，配合自體BMSCs移植治療糖尿病足患者26例，結果移植4周后，痊愈19例，顯效5例，有效2例，無效0例，總有效率為100%。徐恒等[24]對88例糖尿病足潰瘍患者進行自體BMSCs移植，治療組44例配合高壓氧治療，對照組44例采用單純BMSCs移植治療，治療組跛行距離、患肢疼痛、冷感及踝肱指數、經皮氧分壓及踝肱指數都得到顯著改善，兩組治療后EGF、血小板衍生生長因子、血栓素B2、6酮前列腺素都有升高，但治療組效果明顯優于對照組。這說明自體BMSCs移植對糖尿病足潰瘍有很好的臨床療效，配合高壓氧能提高治療效果。 　　2.2 人胎盤來源的間充質干細胞（human placenta derived Mesenchymal Stem Cells， hpMSCs）：hpMSCs分化可能性多、增殖快、免疫排斥性低、使用時無需配型，為優質的MSCs來源。秦丹瑩等[25]發現hpMSCs具有較強的創傷修復能力，而轉染了SDF-1的hp MSCs因其對CXCR4的趨化能力可以更好地聚集于損傷處，加速創面愈合。
　　2.3 人羊膜間充質干細胞（human Amniotic Mesenchymal Stem Cells， hAMSCs）：人羊膜是隔離胎兒和母體的一層隔膜，是產后廢棄物，而且無血管、神經、淋巴等[26]。hAMSCs移植到宿主體內后分泌特定的細胞因子，調節并激活機體固有MSCs增殖、遷移、分化，移植的hAMSCs也歸巢到宿主受損部位，定向增殖、分化為病變部位的組織細胞，參與創面的再生修復，預防瘢痕增生，促進皮瓣存活及神經功能重建。Ertl等[27]發現hAMSCs顯著促進血管生成，誘導了傷口更快愈合，是一種新的更具前景的治療劑。
　　2.4 人臍帶間充質干細胞（human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，hUC-MSCs）：Mc Elreavey等[28]于1991年首次從人臍帶沃頓膠中分離出hUC-MSCs，UC-MSCs可以向受損組織歸巢，并能促進多種組織損傷的修復，如：肺、腎、肝及脊髓等[29]。Shi等[30]將UC-MSCs與皮膚微粒聯合移植到小鼠全皮層損傷創面，可觀察到表皮、皮脂腺、毛囊和汗腺的新生成層，顯著提高損傷后皮膚修復的質量。馬詩雨等[31]將UC-MSCs與自體微粒皮進行混合涂抹于大鼠的背部創面，創面收縮率、新生皮膚較空白對照組好，且愈合速度快，組織中毛細血管及膠原含量明顯增多且排列整齊，VEGF的表達增高。劉玲英等[32]將hUC-MSCs移植于嚴重燒傷大鼠，發現其能遷移歸巢到創面，發揮抗炎、抗凋亡、促進血管新生以及調控Ⅰ、Ⅲ型膠原比例。hUC-MSCs的修復功能與VEGF關系密切，hUC-MSCs通過旁分泌高水平的VEGF，與內皮細胞上的VEGFR2結合，抑制下游的促凋亡蛋白Caspase-3和增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達，發揮促內皮細胞存活、增殖和抗內皮細胞凋亡的作用[33]。此外，hUCMSCs移植后會受到機體內環境的影響，使用適宜濃度（100ng/ml）血管緊張素（Angiotensin Ⅱ，Ang-Ⅱ）預處理的hUC-MSCs可促進其增殖，減少凋亡[33]。
　　Montanucci等[34]使用hUC-MSCs和纖維蛋白制作組織工程皮膚，將其移植至全層創傷的小鼠，創傷愈合后，出現皮膚附屬器，并且能夠增強傷口無顯著瘢痕組織愈合，這種新方法為糖尿病足潰瘍和燒傷的手術治療提供了希望。
　　2.5 人臍帶血間充質干細胞（human Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cells，hUCB-MSCs）：臍血是胎兒出生時經結扎臍帶斷臍，通過臍靜脈穿刺或切開引流收集到的臍帶內和胎盤靠近胎兒一側血管內的血液。臍血中含有豐富的造血干細胞和間質干細胞。臍血干細胞具有很強的增殖、分化及形成集落的能力，受到刺激進入細胞周期的速度及對各種造血刺激因子的反應能力，均高于骨髓和外周血細胞。
　　肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）可以促進血管生成和抑制細胞凋亡。金麗娟等[35]將攜帶HGF的重組腺病毒（Ad-HGF）轉染人臍血干細胞異體移植，顯著提高了燒傷創面愈合速度和質量。干細胞的修復效果還與移植方式有關，史功等[36]發現UCB-MSCs異體移植在一定程度上可以促進免疫缺陷SCID小鼠深Ⅱ度燙傷創面愈合，局部移植效果優于尾靜脈移植。臨床方面，成纖維細胞和/或角質形成細胞組成的各種類型的皮膚替代物常用于治療糖尿病性潰瘍，但效果通常不是很顯著，而Jung等[37]發現使用hUCB-MSCs處理糖尿病傷口顯示出比成纖維細胞更高的細胞增殖、膠原合成和糖胺聚糖水平。hUCB-MSCs的新型商業藥物已經開發出來，作為同種異體干細胞的第一細胞治療產品，并已獲得韓國食品藥品管理局（FDA）批準用于促進膝關節軟骨再生，這也為臨床難愈性創面提供了較好的治療策略。
　　2.6 脂肪間充質干細胞（Adipose-Derived Stem Cells， ADSCs）：2001年，Zuk等[38]首次從人脂肪組織中分離出脂肪組織來源干細胞。Han等[39]發現ADSCs能改善因靜脈缺血再灌注損傷的皮瓣存活率。但ADSCs直接移植于創面后，由于沒有任何覆蓋直接與外界環境接觸，細胞容易直接流失，造成細胞的損傷和死亡。而通過殼聚糖膜覆蓋創面后能形成柔韌透明的薄膜，起到保護創面防止移植的ADSCs流失，從而促進創面愈合的作用[40]。Basu等[41]使用鈣結合蛋白復合物S100A8/A9，一種損傷相關的分子模式（Damage Associated Molecular Patterns，DAMPs）分子預處理的ADSC注射在鼠全層傷口，能顯著促進傷口愈合，這提示當暴露于危險信號分子S100A8/A9時，MSCs促進了有益的適應性反應，存活能力增強。利用DAMP預處理干細胞以增強細胞活力的處理方式，值得進一步研究。在給藥途徑方面，尾靜脈全身應用和局部注射的創面微血管密度未發現明顯差異，但比外敷更好[42]。
　　此外，聯合用藥也是增強干細胞修復功能的方法之一。富含血小板血漿（platelet rich plasma， PRP）凝膠聯合ADSCs促進了血管化新生及增加膠原蛋白合成，可有效加速創面愈合[43]。下肢潰瘍患者局部應用ADSCs和PRP后，創面愈合時間顯著縮短[44]。Minjuan W等[45]將ADMSCs移植到人類無細胞羊膜上，并移植至裸鼠皮膚缺損創面，促進了小鼠全層缺損的愈合和皮膚附屬物的產生。 　　2.7 真皮間充質干細胞（Dermis-derived Mesenchymal Stem Cells，DMSCs）：DMSCs來源于皮膚真皮層，在正常真皮處于相對靜止的狀態，創傷后被激活，參與肉芽組織形成，主要通過旁分泌和分化等多方面發揮促愈合作用。
　　2013年，Ryan[46]發現了人和小鼠胚胎真皮組織中的不同層面至少存在DLK1+/Sca1-和 DLK1-/Sca1+兩種DMSCs（印記基因1：delta-like1 homologue，DLK1;干細胞抗原1：stem cell antigen-1， Sca1）。DLK1+/Sca1-細胞存在于皮膚組織下層，參與皮膚損傷修復，而DLK1-/Sca1+細胞存在于皮膚組織上層，在毛發生成中起關鍵作用。王登高[47]發現DLK1+/Sca1-DMSCs在小鼠皮膚線性傷口和環形切除傷口中，都比DLK1-/Sca1+DMSCs組傷口愈合快，說明DMSC促進傷口愈合的作用是基于DLK1+/Sca1-的細胞產生。
　　2.8 肉芽組織間充質干細胞（Granulation Tissue-derived Mesenchymal Stromal Cells， GT-MSCs）：創傷特別是嚴重燒傷，會產生大量的肉芽組織形成皮膚結構缺損的瘢痕，甚至造成肢體功能障礙。Pelizzo G等[48]從1名12個月大的皮膚全層燒傷接受燒傷治療15d后的男性患者創面分離肉芽組織（Granulation tissue，GT），從GT中分離、擴增出具有典型MSCs形態、表型、增殖和分化能力的GT-MSCs。其通過釋放的可溶性因子表現出抗纖維化特性，這種活性優于BMSCs，提示GT-MSCs可被認為是改善燒傷創面愈合的良好候選方案。
　　2.9 外周血間充質干細胞（Peripheral Blood-derived Mesenchymal Stem Cells，PB-MSCs）：Martinello等[49]采用同源異種的PB-MSCs處理綿羊全層皮膚缺損創面，發現其具有促進肉芽組織和新生血管形成、增加結構蛋白和皮膚附件的作用。PB-MSC可改善淺表損傷和深部損傷的創面愈合質量，而且使用安全，不引起炎癥反應，取材方便。
　　3  毛囊干細胞（hair follicle stem cells， FSCs）
　　毛囊在提高皮膚創傷愈合速度、減少皮膚瘢痕形成及提高創面愈合質量中有重要作用，而在這一過程中起主要作用的是毛囊干細胞。毛囊干細胞位于毛囊上段的Bulg e區[50]（位于皮脂腺開口處與立毛肌附著處之間的毛囊外根鞘）。FSCs具有慢增殖特性并具有分化為表皮、皮脂腺和汗腺等全部皮膚內上皮細胞的潛能。所以，在皮膚創傷時，FSCs不僅參與毛囊和皮脂腺等皮膚附屬器的再生，還參與表皮創面的修復[51]。
　　自體皮膚移植手術中，頭皮作為供皮區可反復取皮十幾次，且不易產生瘢痕，提示毛囊與創面修復的密切關系。陳杏曄等[52]發現七厘散含藥血清能促進FSC的増殖，七厘散君藥血竭的主要成分龍血素A可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進細胞向S期和G2期轉變進，而促進FSCs増殖和分化。將BrdU標記的FSCs與毛囊成纖維細胞聯合皮耐克支架構建的人工真皮構建組織工程皮膚，將其移植入裸鼠全層皮膚缺損創面，在術后各組中BrdU標記的FSC角蛋白15（cytokeratin15，CK15）、CK19和β1整合素表達陽性，隨著移植時間的延長，各組標本中CK14的表達均逐漸增強，表明植入的FSC參與了新生表皮的形成。FSC參與表皮以及毛囊等皮膚附屬器的更新和修復。
　　4  間充質干細胞外囊泡（Mesenchymal Stem Cells-derived Extracellular Vesicles， MSCs-EVs）
　　細胞外囊泡是由各種細胞旁分泌產生的小的球形膜結合片段，包括外泌體（exosome）、膜微粒（microparticle， MP）、微囊泡（microvesicle， MV）等可以轉移包括蛋白質、mRNA和miRNA序列的生物活性分子至靶向受損組織細胞，EVs是MSCs介導細胞間通訊以增強傷口愈合的關鍵分泌產物之一[53]。EVs也參與細胞間通訊，促進受體細胞的發育。Hu等[54]發現ADSCs分泌的外泌體在促進皮膚組織傷口修復方面具有積極作用，并且可以通過優化成纖維細胞促進皮膚傷口愈合。BMSCs外泌體可顯著促進創面愈合、膠原合成和血管化[55]。
　　Pelizzo等[56]皮內注射脂肪干細胞外囊泡（ADSCs-EV）和骨髓細胞外囊泡（BM-EV），可恢復皮膚創傷的皮膚結構，與對應的MSCs治療相比，EVs治療的傷口表現出更好的恢復。ADSCs-EV治療的傷口明顯優于BM-EV，EVs局部移植在皮膚傷口愈合后，再生的組織具有完整的上皮層，真皮乳頭和皮膚附件。因此，MSCs-EVs代表了一種用于皮膚再生的新型“無細胞療法”，可以克服使用天然或工程干細胞相關的障礙和風險。此外，必須進一步研究以優化MSCs的精確劑量。
　　5  小結
　　近年來，干細胞在創傷相關領域的研究進展受到越來越多的關注。目前，關于間充質干細胞的研究，特別是骨髓間充質干細胞在創面修復領域的研究較多。雖然單用干細胞也有一定的效果，但近來的研究通過將干細胞與促進細胞增殖的細胞因子等聯合使用，或利用基因工程技術，在干細胞中導入目的基因，使其在創面修復的過程中表達目的基因而發揮雙重功效，或使用干細胞制作組織工程皮膚等，都大大地增強干細胞的修復能力，豐富了干細胞的運用手段。目前，已有使用姜黃素、龍血竭A等中藥提取物對干細胞預處理，而促進干細胞增殖的相關報道，這也證實了中藥在創傷修復領域更深層次的應用。
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　　[收稿日期]2018-11-28
　　本文引用格式：劉青武，何秀娟，張金超，等.干細胞在皮膚創面修復應用中的研究進展[J].中國美容醫學，2019，28（6）：159-164.
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