藍莓試管苗生根技術研究進展

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　　摘  要：藍莓是21世紀極具有發展潛力的一個新興樹種，組織培養是實現藍莓大規模生產的有效途徑。但由于其根系纖維不發達、生根困難，導致組織培養過程中繁殖系數低。該文綜述了藍莓試管苗生根技術的研究進展，闡述了誘導組培苗生根的機理與方法，分析了影響試管苗生根的主要因素，為組織培養技術用于藍莓研究和種苗生產提供參考。
　　關鍵詞：藍莓;離體;組織培養;生根
　　中圖分類號 S663.9 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2019）10-0025-04
　　Abstract： Semen trigonellae is a new tree species with great potential in this century.Tissue culture is an effective way to realize large-scale Production of it.The root fiber of blueberry is underdeveloped and difficult to take root，  which results in low reproductive coefficient in tissue culture.In this paper，  the research progress of rooting technology of blueberry tissue culture seedlings was reviewed，  the mechanism and method of rooting induction of tissue culture seedlings are described，  the main factors affecting rooting of test-tube seedlings were analyzed.This paper is write to provide reference for the development of Semen Trigonellae study and industrialization.
　　Key words：Semen trigonellae; Tissue culture; Explant; Rooting
　　藍莓，是中國對杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）植物中藍果類型的俗稱[1]，其果實中含有較多的花色素苷、黃酮等生理活性成分，具有多種營養保健功能和較高的經濟價值[2]，是一種極具商業前景的小漿果類果樹。中國藍莓的概念范疇是包括目前國內主栽原產北美的高叢藍莓、矮叢藍莓、兔眼藍莓和原產中國的篤斯越桔（橘），以及少量進口歐洲越橘（Bilberry）的果實和植株，與之相關的名稱包括藍莓、blueberry、越桔、越橘、藍漿果、篤斯越桔（橘）[1]。藍莓的傳統繁殖方法主要有扦插和分株繁殖2種，存在繁殖效率低、規模小、出苗質量參差不齊等問題，難以滿足市場的需求。而應用植物組織培養技術，具有繁殖周期短，繁殖系數高，能在短時間內繁殖出大量無菌、高品質的種苗的優點，現已成為藍莓商業化育苗的新方向。
　　藍莓在中國的研究起步較晚。1981年，吉林農業大學郝瑞教授從美國引種藍莓。1990年，陳慧都等發表了越桔組培工廠化育苗研究成果，隨后各地開始對藍莓育苗技術進行研究。苗木繁育技術的發展，尤其是組培工廠化育苗技術的應用，加速了中國藍莓產業的發展[1]，組織培養快速繁育已成為了藍莓苗木繁育的主要途徑[3]。目前，國內外已開展了許多藍莓新品種或優選品系的組織培養繁殖技術的研究，積累了比較豐富的經驗與數據，但有關藍莓離體繁育瓶內生根的問題至今仍是一個急需攻克的難題。
　　本文綜述了藍莓試管苗生根技術研究進展，闡述誘導組培苗生根的方法，分析影響試管苗生根的主要因素，為組織培養技術用于藍莓研究和種苗生產提供參考。
　　1 根發生、發育的形態解剖構造
　　根系發生于根原基，根原基通常分為2種，誘生根原基和潛伏根原基。誘生根原基是從外植體的維管形成層、韌皮薄壁組織細胞、韌皮射線等部位形成的，在扦插前并不存在;而潛伏根源基在外植體取材時便具有，但處于休眠狀態，待接種后在環境適宜下發育成根[3]。通常由誘生根原基發育不定根的樹種扦插生根較難。
　　由于根原基形成的時間、部位和機制的差異，不定根的形成可分為皮部生根型、愈傷組織生根型和中間生根型。不同植物的生根和不定根形成類型都不同：魏麗秀等在研究山蒼子扦插生根解剖時發現，其生根類型為誘導生根型[4]。韓超等在研究桉樹無性系組培生根發現，有皮部生根型，也有愈傷組織生根型[5]。
　　目前較少涉及藍莓組培生根的解剖學觀察。王雪嬌對美登藍莓組培苗生根解剖學研究時發現，美登組培苗的莖中沒有潛伏根原基的存在，不定根是由誘生根原基發育而來的，并且誘生根原基起源于木質部細胞，經過不斷的分化形成根原基，最終形成不定根[6]。王濟紅對兔眼藍莓扦插過程中插條下剪口形態變化進行觀察，結果表明，兔眼藍莓的根系形成于愈傷組織，愈傷組織形成分為3個階段，即愈傷組織誘導階段、愈傷組織初產生階段和愈傷組織大發生階段[7]。
　　2 生根方法
　　組培苗的生根方法有試管內和試管外2種，都需要使用植物生長調節劑生長素類物質誘導。
　　試管內生根分為瓶內固體培養基生根、瓶內淺層液體培養基生根法。固體培養基生根包括：（1）持續誘導生根法：試管苗在含有生長素的固體培養基（生根誘導培養基）上持續培養，誘導不定根發生[8];（2）生長素—活性炭（生長素—AC）誘導生根法：試管苗先在含生長素的培養基上培養一段時間以誘導根原基的發生，再轉移到含AC的培養基上持續培養以促進根原基生長;（3）生長素速蘸—AC誘導生根法：將試管苗基部浸入生長素溶液中一定時間，轉接到含AC的固體培養基上持續培養。試管內根原基發生較容易，生根試管苗的根系無吸收功能或極低，移栽根系容易受到瓊脂的污染，成本較高[9]。 　　試管外生根是將試管苗作為微型插穗直接扦插于無菌基質上使之生根形成小植株的方法。試管外生根的優點在于其把生根與馴化相結合，節約了育苗成本，同時瓶外生根苗避免根系更加健壯，且生出的根系有正常的輸導組織[10]。但當試管苗從無菌狀態的高溫、高濕、弱光的環境移栽到有菌狀態的自然條件，一些弱苗、小苗會因不適應環境條件的變化而死亡[11]。
　　這2種方法在藍莓組培苗生根中都有應用。劉忠輝等采用藍莓品種‘夏普藍’繼代芽苗為試材，實驗比較了藍莓組培苗3種方法（瓶外生根、固體培養基生根、瓶內淺層液體培養基生根）的生根效果，結果表明，瓶內淺層液體培養基生根效果較好[12]。潘忠強等探討了固體培養基生根和瓶外生根對藍莓品種‘巴爾德溫’生根的影響，結果表明，表面瓶內生根處理的生根率更高，但瓶外生根的質量更好[13]。研究者尚未對最佳的生根方法達成一致的結論。不同生根方法所用的基質、植物生長調節劑種類、含量均不同。
　　3 生根影響因素分析
　　3.1 品種與基因型 藍莓基因型差異對不定根的分化有著重要影響，不同品種材料在形態結構、生長發育規律及對外界環境條件的適應能力等方面都存在明顯差別，試管苗生根的難易程度也有差別。烏鳳章等研究了8個藍莓品種生根情況，結果表明，不同藍莓品種的插生根能力不同，其中公爵的生根能力最好，達到86.3%，而北陸生根能力最差僅28.3%[14]。朱世銀等對安娜、萊克西、南大、奧尼爾等4個藍莓品種的組培復壯瓶苗進行了試管外生根，結果表明，4個品種中，南大生根率最高達60%，奧尼爾第2為49%，萊克西第3、為44%，安娜最低只有27%[15]。張舵等以‘斯巴坦’及‘北陸’2個藍莓品種試管苗為試材，結果表明，2個藍莓品種在相同的條件下生根無明顯差異[16]。隨著現代分子生物學技術的發展，基因型差異與生根關系還有待進一步挖掘。
　　3.2 基本培養基 低無機鹽濃度可以促進植物根系生長，因此大部分藍莓生根培養基生根培養基采用1/2WPM添加不同濃度的生長素。甄成等對雜種藍莓（野生ב美登’）在添加IBA的1/2WPM培養基進行生根誘導，結果表明，生根率高達88%，且生根周期僅為40d，移栽成活率達到85%以上[17]。梁文衛等以藍莓品種美登的無根試管苗為試材，脫脂棉為支持物，添加1/2WPM及不同濃度的IBA、NAA和蔗糖為培養基，生根率為100%[18]。除了1/2WPM培養基，WPM培養基、1/2CQWL、改良1/3WPM培養基培養基也被用作生根的基本培養基。黃作喜以添加IBA的WPM為培養基時生根率為40%，在添加活性炭后生根率有所上升[19]。黃科等采用1/2CQWL培養基添加適量IBA誘導藍莓’Sharpblue’生根，生根率達73%，單株生根4～5條[3]。陽翠等，研究了北高叢藍莓‘萊格西’在改良WPM、改良1/2WPM、改良1/3WPM生根情況，結果表明，1/3改良WPM生根效果最佳[20]。但鑒于藍莓種和品種豐富，對不同品種和外植體有必要系統、綜合地分析培養基成分對試管苗生根的影響，以獲得最佳基本配方。
　　3.3 激素處理 無論試管內還是試管外生根，適量使用生長素類物質都可以誘導根原基的發生，并促進不定根的生長。常用的生長素類物質主要有IBA、NAA、IAA等，其中IBA使用最多[21]。不同生根方法所用的植物生長調節劑種類、用量均不同，在這里需要進行分開討論。
　　3.3.1 試管內生根 在IBA持續誘導生根法中，IBA的添加濃度一般在0.05～5mg·L-1，使用濃度因藍莓品種及培養基中其他因素而異。李森等研究認為高叢藍莓生根的適宜濃度為IBA0.1mg·L-1[22]。吳光洪等以兔眼藍莓優良品種‘粉藍’壯苗后進行瓶內生根，添加0.8mg·L-1吲哚丁酸（IBA）+0.1g·L-1活性炭（AC）生根效果最好[23]。梁文衛等發現藍莓品種‘美登’在添加2.0mg·L-1IBA、0.2mg·L-1NAA和20g·L-1蔗糖的培養基生根率達100.0%，20d后即可達到移栽要求[18]。鄭理喬等將藍莓繼代培養試管苗轉入添加0.2mg·L-1IBA，并含100～200mg·L-1活性炭的培養基時生根情況最為理想[24]。朱芳明等研究表明，“兔眼藍莓”的最佳生根激素濃度為IBA2.0mg·L-1，生根率達92.10%，生根數多，根長勢好[25]。王大平等研究表明，兔眼藍莓試管苗添加IBA0.5mg·L-1和活性炭0.3%的培養基上，平均生根率達78.7%[26]。孫書偉等以藍莓品種‘藍豐’、‘伯克利’組培苗為材料，結果表明，藍豐在IBA0.1mg·L-1生根效果更好，伯克利在IBA0.05mg·L-1的培養基上更好[27]。
　　生長素速蘸—AC誘導生根法，用來速蘸的IBA溶液的濃度一般在100～500mg·L-1，蘸取時間在2～10s。韓德偉研究了外源激素IBA對藍莓組培苗瓶內生根的影響發現，將藍莓苗浸蘸200mg·L-1IBA中5s后再接種到基本培養基中，生根速度加快，發根周期變短且生根率明顯提高[28]。陽翠等用300mg·L-1的IBA浸蘸5s后，接種于生根培養基中，10d后藍莓組培苗就開始長根，且生根率也有所提高[20]。
　　3.3.2 試管外生根 試管外生根方法與生長素速蘸–AC誘導生根法生長素的濃度接近。區別在于試管外生根法在速蘸后扦插到基質上，將移栽與生根同步進行。姚平等將經過復壯的組培苗剪成2cm左右的莖段，置于100mg·L-1IBA溶液中并立即撈出，于溫室中扦插到以苔蘚為基質苗床上，立即扣小拱棚保，40d生根成活率可達70%～80%[29]。王雪嬌等以篤斯越橘優系SL-1的試管苗莖段為試材，研究不同濃度的IAA與IBA溶液浸蘸、浸蘸時間及浸蘸深度對其生根的影響，結果表明：篤斯越橘優系SL-1試管苗莖段浸蘸IBA比IAA生根效果好，且在300mg·L-1IBA中浸蘸10s時，生根率與生根條數最高，生根率達100.0%;試管苗生長健壯，生根快;試管苗莖段浸蘸不同深度時，以基部浸蘸生根效果最佳[30]。李京等將“美登”藍莓組培苗蘸取ABT1號500mg·L-130s情況下生根率達97.0%[31]。烏鳳章提出北陸插穗經生根劑處理后，扦插生根質量明顯高于對照，其中在1000×10-6的IBA中速蘸，扦插生根效果最好，生根率達到82.1%，其次是在50×10-6的IBA、150×10-6的NAA、50×10-6的ABT2號中浸泡2h，生根率可達70%以上[14]。 　　3.4 環境條件 試管苗生長的環境條件是指生長環境中的溫度、光照強度、水分、氣體交換、營養成分等。試管內生根時濕度達到飽和、營養成分充足，主要考慮溫度、光照等。試管外生根則更容易到環境條件的影響。
　　3.4.1 試管內生根 暗處理與試管苗繼代次數也是影響藍莓生根的重要因素[21]。研究表明，將藍莓試管苗先暗培養進行7d，再進行光照培養，可明顯提高生根率;對于藍莓試管苗繼代次數而言，只有繼代到5代后，才可進行生根培養，且隨繼次數增加，生根率不斷提高[32]。趙勇剛等在改良1/2WPM培養基中加入0.6mg·L-1IBA和不同含量活性炭（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）誘導藍莓組培苗生根，研究活性炭對藍莓組培苗生根的影響，結果表明，當培養基中含活性炭0.10%～0.20%時，培養30d左右有根發生，培養50d后生根率比對照（不加活性炭）增加66.0%～91.8%;培養基中加入0.10%活性炭可抑制組培苗落葉，促進組培苗健壯生長[33]。
　　3.4.2 試管外生根 在組培苗試管外生根的過程中，溫度和濕度是是至關重要的影響因素。氣溫可滿足芽的活動和葉片的光合作用，地溫則影響生根速度，一般來說土溫略高于氣溫有利于生根[34]。濕度對植物扦插生根也有重要的影響，剛扦插時組培苗沒有根系，這個階段的空氣濕度是維持組培苗存活的關鍵。研究發現，溫度保持在20～25℃，扦插生根效果較好[35]。以篤斯越橘優系SL-1組培苗為試材，探討環境條件的影響，結果表明，組培苗瓶外生根的最佳環境條件為22～25℃，濕度80%[36]。美登藍莓組培苗適宜的培養溫濕度條件為溫度25℃、濕度75%[37]。前7d應保持小拱棚內空氣相對濕度在95%以上，之后14d保持相對濕度在85%～90%，溫度保持在20～28℃，20d后逐漸揭開保濕的塑料膜。為了保持插穗的水分，可以采用自動間歇噴霧裝置，以提供充足的水分。此外，還可以利用遮陽網來維持空氣濕度[29]。
　　光照對組培苗試管外生根也有一定的影響，其主要是通過對插穗自身代謝的控制來實現的。光照刺激芽的生長，抑制根的發育，因此，在誘導試管苗生根時應適當遮陰，刺激插條先生根，后抽梢發葉，提高試管苗的成活率。在扦插時，要選擇合適的光照強度，從而利于生根[39]。一般30%～50%的透光量較為適宜，且50%左右的透光率最佳。強光照射會使插穗過度失水而枯萎，而過度的遮陰又會導致葉片黃化脫落。另外，適度的光照可以使嫩枝的葉片進行少量的光合，從而為生根提供能量[6]。每天光照時間8～10h，4—5月栽植瓶外生根數量多[36]。
　　在扦插過程中，基質起著重要的作用，它可以支持和固定植物，為植物提供相對適宜的生長環境。不同基質的保濕性、透氣性和抗菌性等能力都不相同，因此在選擇基質時，要根據植物本身的特點進行選擇。以“園藍”品種為試材，進行了架空苗床和地表苗床瓶外生根效果的比較分析，并對瓶外扦插生根基質進行篩選，得出混合基質椰糠和水苔（體積比6∶4）生根效果好，生根率達96%以上，生根苗移栽的最佳基質是草炭土∶苔蘚為2∶1[36]。有研究者以美登藍莓為試材，研究了不同基質對"美登"藍莓組培苗室外移栽的影響，結果表明，移栽基質以沙子+草炭土（1∶1）最佳[37]。
　　4 展望
　　藍莓因其豐富的營養保健價值與廣闊市場前景，在世界各地廣泛種植。中國藍莓研究雖然起步較晚，但是發展迅速，藍莓的組織培養技術也不斷成熟。目前，藍莓的試管苗生根研究取得了一定的成果，影響生根的因素主要有外植體、培養基成分、激素處理、生根環境（溫度、濕度、光照等），部分品種的試管苗已經能夠實現了生根移栽成活。
　　今后應加強生根機理方面的研究，從解剖學、生理生化、分子生物學等方面進一步探尋不定根發生的機理，探尋生根過程中、內源激素、相關酶活性的變化規律，分析生根過程中的基因表達等，這些在其他木本植物上已經有所涉及。生長素反應因子（ARFs）是植物界特有的轉錄因子蛋白，它們與生長素早期反應基因（Aux/IAA基因，SAUR基因和GH3基因）啟動子內的生長素順式作用元件TGTCTC（AuxREs）特異性結合來調節這一類基因的表達;宋曉波等確定核桃不定根發生過程中高效、穩定表達的內參基因，研究不定根發生相關基因的表達模式[38]。相信隨著研究的不斷深入，與藍莓發根有關的基因將會被進一步挖掘和利用，從根本上解決藍莓生根問題，促進藍莓組織培養技術的推廣應用。
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