龍須藤莖皮甲醇提取物生物活性初探

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　　摘要 龍須藤Bauhinia championii在醫用方面已證實具有良好的抗菌、消炎作用，但其在農用方面的活性研究還鮮有報道。本研究分別采用菌絲生長速率法和種子生物測定法，首次測定龍須藤莖皮甲醇提取物及分離組分對6種農業有害真菌和單、雙子葉兩種植物的生物活性。結果表明，龍須藤甲醇浸提物對水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae有一定的抑制效果，對油菜Brassica napus和稗草Echinochloa crusgalli的根芽均沒有抑制作用。但其甲醇浸提物中分離的大部分組分對供試病原菌和植物的根芽都表現出一定抑制作用。殺菌活性方面：10號組分對西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum和番茄早疫病菌Alternaria solani的抑制效果最好，抑制率分別達到80.0%和78.0%，除草活性方面：1～3號組分對油菜根的抑制率較高，達到50%以上，2號組分對稗草根的抑制效果最好，達到68%?？梢姡堩毺偾o皮提取物中含有具有良好殺菌活性和除草活性的物質。
　　關鍵詞 龍須藤; 提取物; 生物活性; 植物源農藥
　　中圖分類號： S 482
　　文獻標識碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018236
　　Abstract Bauhinia championii has excellent antibacterial， antiinflammatory and other medical effects， but few studies have been reported on its agricultural biological activities. In this study， mycelia growth rate and seed bioassay methods were used to determine the bioactivities of the methanol extracts and separated components from B. championii against six species of agricultural pathogenic fungi and two weeds. The results showed that the methanol extracts had moderate inhibitory activity against Magnaporthe oryzae， and had no inhibitory effects on the root and buds of Brassica napus and Echinochloa crusgalli. However， some of the components isolated from the methanol extracts showed moderate inhibition against the tested pathogens， and the roots and buds of tested plants. In particular， component 10 showed the best inhibitory effect against Fusarium oxysporum and Alternaria solani， with an inhibition rate of 80.0% and 78.0%， respectively. The components 1-3 showed more than 50% inhibition rate against the root of B. napus. The component 2 had the best inhibitory activity against E. crusgalli， reaching 68%. The results provided a new idea for the development of new botanical pesticides.
　　Key words Bauhinia championii; extracts; biological activity; botanical pesticide
　　龍須藤Bauhinia championii是豆科蘇木亞科羊蹄甲屬有花植物。分布于越南、印度尼西亞、印度以及中國的廣東、湖南、湖北、江西、福建、浙江、貴州、廣西、臺灣等地，生長于海拔200～1 000 m的地區，一般生于丘陵灌叢、山地疏林以及密林中，尚未人工引種栽培。福建福州永泰縣青云山地區龍須藤資源豐富[1]。龍須藤性平、苦澀，無毒，主要含有黃酮類[25]、多糖[1，6]、揮發油[7]等，具有抗炎鎮痛[810]、消除自由基[1112]、抗菌[13]、抗腫瘤[14]等功效，在畬醫中作為一種治療痹癥的特效藥[15]，常用于治療風濕疼痛。龍須藤農用生物活性方面的研究還鮮有報道。在減肥減藥不減產的農業大背景下，植物源農藥因其對人畜安全、環境相容性好、低殘留等優點而備受人們的重視與青睞[1617]。本研究對龍須藤莖皮進行甲醇冷浸提取，提取物采用硅膠柱層析進行初步分離，并檢測了甲醇浸提物及分離組分的農用殺菌和除草活性，旨在為植物病害和草害的防治及新植物源農藥的研究與開發提供新思路。
　　1 材料與方法
　　1.1 供試植物
　　2017年2月于廣西賀州市信都鎮聯盟村民黎山采集的新鮮龍須藤，由中國科學院武漢植物園江明喜研究員鑒定為豆科羊蹄甲屬植物龍須藤Bauhinia championii。
　　1.2 供試種子和菌種
　　油菜Brassica napus和稗草Echinochloa crusgalli種子由長江大學農藥研究所提供;西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum、番茄早疫病菌Alternaria solani、水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae、水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani、白芨白絹病菌Sclerotium rolfsii、小麥赤霉病菌Fusarium graminearum等病原菌菌種由長江大學農學院植物保護教研組提供。 　　1.3 主要儀器及供試藥劑
　　FA2004電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司;SWCJ2FD型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司;QT型超聲波清洗器，天津市瑞普電子儀器公司;DLF18型流水式中藥粉碎機，溫州頂歷醫療器械有限公司;RE5205型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠;ZFⅠ型三用紫外分析儀，上海顧村電光儀器廠;ES315型高壓滅菌鍋，Tomy Kogyo Co.，Ltd;SPX250型生化培養箱，上海躍進醫療器械有限公司;BIC400型人工氣候箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠;200～300目硅膠，青島譜科分離材料有限公司。石油醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮和吐溫80均購自天津天力化學試劑有限公司。
　　1.4 龍須藤莖皮甲醇提取物的制備
　　參照姚宗理等的提取方法[18]，對新鮮的龍須藤莖皮進行脫落處理，于室內晾至近干，40℃烘至恒重，用中藥粉碎機粉碎，過60目標準篩。取250.00 g莖皮粉末，用5倍體積的90%甲醇室溫浸提5次，每次48 h，合并提取液，用旋轉蒸發儀50℃濃縮，回收甲醇，獲得粗提物浸膏72.54 g。取其中10 g冷凍干燥備用，剩余浸膏用少量甲醇熱熔，于50℃水浴鍋中與60.00 g硅膠（80～100目）充分拌勻，蒸干溶劑，裝入硅膠層析柱 （40 mm×600 mm， 200～300目硅膠500.00 g），先后加入脫脂棉和無水硫酸鈉填充柱體，依次用乙酸乙酯石油醚和乙酸乙酯甲醇兩種體系進行梯度洗脫，各梯度溶劑為3 500 mL，每200 mL為1個流分，減壓濃縮。各流分以石油醚、乙酸乙酯、甲醇不同極性配比液為展開劑，用254 nm紫外燈（TLC）或碘缸檢識，在薄層層析硅膠板（GF254）展開比較，合并Rf值相近的流分，最終獲得11個組分。
　　1.5 龍須藤甲醇提取物對真菌生長的抑制作用
　　在電子天平上準確稱量0.50 g龍須藤莖皮甲醇浸提物于15 mL樣品瓶中，用1 mL丙酮溶解，超聲助溶，于超凈工作臺中用含0.1%吐溫80的無菌去離子水定容至50 mL，配成10 mg/mL母液。用同種方法分別稱取0.25 g各分離組分于樣品瓶中，等量丙酮溶解，超聲助溶，同等條件定容至50 mL，配成5 mg/mL母液備用。
　　采用菌絲生長速率法[19]。分別制備含1 mg/mL甲醇浸提物及含0.5 mg/mL分離組分的PDA培養基，以等量溶劑為對照[18]，將供試菌接種至培養基平板中間，每處理3次重復，置于28℃生化培養箱中培養。每天觀察菌落生長情況，當對照組的菌落長至培養皿底部3/4面積時用十字交叉法測量菌落直徑[20]，計算菌落生長抑制率。
　　菌落生長抑制率=
　　對照組菌落直徑-處理組菌落直徑對照組菌落直徑×100%。
　　1.6 龍須藤甲醇提取物對植物根和芽生長的抑制作用
　　采用種子生物測定法[21]。取兩張中速濾紙鋪于90 mm 培養皿中，分別將1 mg/mL甲醇浸提物及0.5 mg/mL分離組分滴于培養皿中，每皿加5 mL，以等量溶劑為對照，每處理3次重復。種子室內催芽，挑選發芽勢相同的種子鋪于滴有藥液的培養皿內，每皿15粒。置于人工氣候箱內培養，于溫度28℃，濕度70%，光照度1 100 lx，光周期L∥D=14 h∥10 h下培養3～4 d，測量其根長和芽長，計算相對抑制率。
　　根（莖）生長抑制率=對照組根（莖）長度-處理組根（莖）長度對照組根（莖）長度×100%。
　　1.7 數據統計
　　所有試驗平行測定3次，數據均以“平均值±標準差”表示，用Microsoft office 2010和DPS v 13.5進行數據統計和分析;不同處理采用方差分析和Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗（P<0.05）。
　　2 結果與分析
　　2.1 甲醇浸提物的制備與分離
　　采用上述提取方法，得到龍須藤莖皮浸膏72.54 g，提取率為29.01%。取其中62.54 g（10 g冷凍干燥備用）經柱層析分離、TLC檢測，整合相同流分，減壓脫除溶劑，得到11個組分，總質量26.10 g（表1），回收率41.73%。
　　2.2 龍須藤甲醇浸提物對真菌生長的抑制作用
　　抑菌活性試驗結果（表2）顯示，龍須藤莖皮甲醇浸提物及部分分離組分對供試病原菌有不同程度的抑制效果，其中3號組分對水稻紋枯病菌，10號組分對西瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌和水稻稻瘟病菌的抑制效果均超過50%，10號組分對西瓜枯萎病菌的抑制效果最好，抑制率為80.00%。
　　2.3 龍須藤甲醇提取物對植物根芽生長的抑制作用
　　對油菜和稗草根芽生長的抑制試驗結果（表3）顯示，龍須藤莖皮甲醇浸提物對供試種子芽和根的生長都沒有抑制效果，可能由于粗提物的成分比較復雜，該濃度下有效成分不表現抑制作用。但分離組分中除了6號組分對供試種子芽和根的生長都沒有抑制效果外，其余組分都表現出了一定的抑制活性，其中2號組分對油菜和稗草根的生長抑制率都超過了60%，分別為60.12%±2.77%和68.80%±2.33%;3號組分對油菜根的生長抑制率也達到了60%。由此可見，2號和3號組分中存在活性較高的抑制油菜和稗草生長的物質。
　　3 結論與討論
　　龍須藤是一種重要的中藥材，在醫學領域有著廣泛的用途，但在農用生物活性方面的研究與開發方面卻鮮有報道，本研究以6種農業有害真菌和兩種常見田間單雙子葉植物為供試生物，研究龍須藤莖皮甲醇提取物的農用生物活性。將龍須藤莖皮用甲醇冷浸提取，浸提物采用硅膠柱層析進行初步分離。首次測試了甲醇浸提物和分離組分的離體殺菌和除草活性。結果表明龍須藤甲醇浸提物對稻瘟病菌表現出一定的抑制效果，對油菜和稗草的根和芽均沒有抑制作用，但是大部分分離組分對供試病原菌和植物的根、芽都表現出一定抑制作用。殺菌活性方面： 10號組分對西瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌的抑制效果最好，抑制率分別達到了80.0%和78.0%，可進一步分離純化出高活性的化合物單體，有望開發出新的植物源農藥，用于作物上西瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌的防治;除草活性方面：1～3號組分對油菜根的抑制率較高，均超過了50%，2號組分對稗草根的抑制效果最好，抑制率達到了68.80%。由此可初步確認龍須藤莖皮中存在具有較強除草活性的物質，具備開發為新型植物源除草劑的潛力。與合成農藥相比，植物源農藥不僅對環境友好，而且往往具有復雜的作用機制和新穎的靶標，是當前農藥開發與研究的熱點。本研究闡明了龍須藤莖皮甲醇浸取物的部分分離組分具有良好的農用殺菌和除草活性，可為利用龍須藤開發新型植物源農藥提供新思路。 　　參考文獻
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