微生物限度檢查的影響因素探討
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摘 要：結合日常工作實踐，對微生物限度檢查過程中影響檢查結果的因素進行總結分析，并根據各個因素提出相應的應對措施，消除影響因素對檢查結果的影響，保證結果的科學準確、客觀公正。
關鍵詞：微生物;限度檢查;影響因素
Abstract：Based on the daily work practice， the factors affecting the results of microbial limit test were summarized and analyzed， and the corresponding countermeasures were put forward according to each factor， so as to eliminate the influence of the factors on the results of microbial limit test and ensure the scientific， accurate and objective results.
Key words：Microorganism; Limit check; Influence factors
中圖分類號：R155.5
食品和藥品是人類賴以生存和發展的最基本的物質條件，食品和藥品安全涉及人類最基本的權利和生命保障，更關系到國家的穩定和發展。影響食品和藥品質量的因素諸多，而微生物污染是其中一個非常重要的因素，所以對微生物限度檢查過程中影響檢查結果的因素進行分析也就極為重要，現將日常工作實踐中發現的影響因素和對應對措施進行整理分析。
1 環境與設施設備的影響
1.1 環境影響
我國藥典明確規定，微生物限度檢查應該在受控潔凈環境下（不低于D級）的局部不低于B級單向流空氣區域內進行，且潔凈實驗室應定期進行微生物監測，內容包括非生物活性的空氣懸浮粒子數和有生物活性的微生物監測，其中微生物監測包括環境浮游菌和沉降菌監測，及關鍵的檢測臺面、人員操作服表面及五指手套等的微生物監測[1]。日常工作中，如果未對環境實施定期監測，導致環境實施未達到規定要求的，就會導致空白試驗長菌，微生物結果偏離，嚴重的甚至出現假陽性的不合格結果。針對此情況，如果出現空白對照長菌，首先要找原因，看是環境消毒不徹底還是環境凈化設施空氣過濾老化漏風問題，如果是消毒問題就必須檢查消毒方法方式是否合理，用紫外滅菌的檢查紫外燈滅菌效果，可采用沉降菌或紫外滅菌效果指示卡驗證，達不到要求就必須更換紫外燈或更換滅菌方式方法，且紫外燈離工作臺面距離不能太遠，如果是環境凈化設施問題的就要清洗初中效或換高效過濾器，查出原因解決問題。
1.2 設備影響
微生物檢測使用到的主要設備包括電子天平、培養箱、干燥箱、滅菌鍋、水浴鍋，生物安全柜，所用到的設備均要進行檢定校準，并把檢定校準結果中的偏差修正值應用到實驗中，這樣才能保障稱取樣品和整個檢驗過程的準確性。所有實驗過程中用到的無菌器具均需要滅菌處理后才能使用，且干熱滅菌和濕熱滅菌的滅菌效果達到無菌要求，滅菌效果可以用滅菌指示條進行監控驗證。曾經有檢驗同行就因為干熱滅菌時不注意，導致影響最后檢驗結果出現不合格的假陽性，原因是其在放置滅菌用品時堆放過于密集，干熱滅菌時溫度不均勻導致顯示溫度雖然已達到滅菌溫度，但是密集處未達到滅菌效果。各種菌種培養溫度在標準許可范圍，細菌、霉菌分開培養，厭氧培養在厭氧培養箱內進行;陽性菌必須在生物安全柜中操作，且陽性操作間與樣品檢測間相互獨立，避免交叉污染。
2 實驗人員的影響
2.1 對無菌概念理解不徹底
操作人員對操作過程無菌概念理解不徹底，導致人員自身污染。實驗人員進入實驗潔凈區域時，要穿戴潔凈工作服、鞋、帽、口罩，頭發不外露，不留指甲，條件允許戴無菌手套操作，此步驟如果頭發外露和留有長指甲在操作時就容易導致人為污染。
2.2 操作人員操作污染
試驗操作全過程必須符合無菌技術要求，操作時盡可能在近火焰區或相對無菌區操作，取用無菌吸管加液時手不接觸吸管下半部分，吸管與樣品接觸的下半部分至吸管尖端不接觸任何外露物品，使用吸管接種于試管或培養皿時，吸管尖不得接觸試管或培養皿外蓋和外壁。使用吸耳球輔助吸管取樣時，有的不熟練者會出現供試液接觸吸耳球或液體直接進入吸耳球的情況，這個就是嚴重操作問題。筆者帶領實習生進行檢測時就出現過此問題，當時所檢測樣品在結果計數時發現菌落數多不可數，問題嚴重為結果不合格。針對此情況，筆者用送檢的同批樣品重新復試且平行3次實驗，復試結果均為菌落總數為0，同時與實習操作人員溝通操作過程，發現問題是操作者在取樣時，出現供試液吸到吸耳球內部后返回樣品待測液的情況，也就是直接的污染操作。
3 檢驗方法的影響
藥典微生物限度檢查明確規定，供試品的微生物計數方法應進行方法適用性試驗，以確保所采用的方法適合該產品的微生物計數[1]。此驗證要求針對藥品微生物檢驗（食品檢驗沒有明確規定）。進行檢驗方法的驗證，即確認供試品在該試驗條件下無抑菌活性或抑菌活性通過處理不影響存在微生物的計數，一般可以采取的方法有培養基稀釋法、薄膜過濾法、加入中和劑或滅活劑。通過以上驗證方法中的一種或多種聯用消除抑菌活性，按照相關要求加入陽性菌驗證微生物回收率符合規定后該方法就可以成立，作為藥品生產企業是必須自己進行方法適用性驗證或委托有資質的第三方進行，如果是第三方檢驗部門可以向生產企業索取方法適用性結論，根據結論方法進行檢驗。
4 培養基的影響
4.1 培養基質量
培養基自身質量直接影響檢驗結果的準確性，現今廣泛使用培養基都是成品脫水培養基，只要嚴格按照產品說明書進行儲存和配制，基本不會影響其成品質量。但是必須注意培養基瓶開口后，特別要注意瓶蓋的密閉性，如果瓶蓋未擰緊就會發生培養基吸濕結塊嚴重的甚至發生變質，從而影響培養基的質量，如果條件允許的情況下，可以把開口后的培養基放置在除濕柜中保存。 4.2 培養基的滅菌和使用
培養基滅菌應嚴格按照使用說明溫度條件進行，各個滅菌溫度不同的培養基必須分開滅菌，不能把溫度接近的培養基合并滅菌，比如把115℃和121℃滅菌溫度合并一起是不可取的，如果要求煮沸即可的嚴禁進行高壓滅菌。培養基傾注的溫度和厚度也是實驗正確與否的關鍵，滅菌后的培養基可以放置于不超過45℃的水浴鍋內保溫，特別注意水浴溫度不得超過45℃，溫度太高容易使樣品中活性微生物受損或死亡，溫度過低會導致瓊脂發生凝固致使樣品供試液混合不均勻;傾注厚度一般直徑為90 mm的培養皿傾注培養基量以15～20 mL為宜，培養基太薄，在培養過程中可能因水分蒸發而影響菌落生長，培養基太厚不宜混勻，且水分太多會造成菌落蔓延生長，影響計數。如果出現水分太多產生的蔓延，除了適量的培養基外，如果仍然出現蔓延不可計數可以采用陶瓦蓋法，即把培養皿的蓋子換成陶瓦蓋進行培養可有效去除水分的影響[3]。
5 菌落計數誤差的影響
在進行菌落計數時，經驗不足容易導致計數結果出現多計或漏計。因為菌落生長有大有小且形態各異，有的太小肉眼難以發現計數，有的藥渣或輔料和菌落形態相似被誤計入計數結果。如果菌落太小，可以借助放大鏡或菌落計數器輔助計數;如藥渣或輔料和菌落形態相似的可以在培養基中加入經驗證濃度的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），其原理是TTC和活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶反應，生成紅色的還原產物，使菌落變紅色，便于菌落計數，通過顏色可以快速地把菌落和雜質區分計數，同時有效抑制部分菌落產生蔓延。筆者在日常工作中曾驗證過加入培養基TTC適宜濃度為1.0～2.5 mg/100 mL[4]，該濃度范圍即可使菌落變紅色便于計數，同時不抑制菌落生長。
參考文獻：
[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版 三部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2005.
[2]楊 靜.藥品微生物限度檢查法的影響因素分析[J].中國藥事，2008，22（2）：1095-1096.
[3]王文麗，馬慶慧.藥品微生物限度檢查法的影響因素及對策[J].中國醫藥前沿，2007，2（17）：90-91.
[4]李學興，石 琳，梁 偉.不同濃度TTC在微生物檢測培養基中的應用[J].食品安全導刊，2017（12x）：70-71.
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