多種單味中藥對禽多殺性巴氏桿菌C48-1的抑菌作用研究

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　　摘要：試驗選取厚樸酚、黃藤素、秦皮、大黃素和黃柏5種中藥提取物，采用藥敏紙片法和布氏肉湯稀釋法對禽多殺性巴氏桿菌C48-1進行抑菌試驗。體外抑菌試驗結果表明，厚樸酚、黃藤素和秦皮提取物的抑菌圈大小分別為22.0、11.3、15.6 mm，最小抑菌濃度（MIC）分別為8、256、64 μg/mL，最小殺菌濃度（MBC）分別為16、512、256 μg/mL;大黃素和黃柏提取物對C48-1沒有抑菌作用;厚樸酚的抑菌作用最強，秦皮次之，黃藤素最弱。培養禽多殺性巴氏桿菌C48-1時，培養基中加入厚樸酚含量為6 μg/mL時，細菌的生長速度相比對照組受到明顯抑制，當藥物濃度為MIC（8 μg/mL）值時，禽多殺性巴氏桿菌C48-1生長被完全抑制。從體內抑菌試驗結果可知，厚樸酚對禽多殺性巴氏桿菌C48-1侵染江漢雞的保護力最高，為50%。該結果為進一步研制中藥制劑預防禽多殺性巴氏桿菌病提供了理論基礎。
　　關鍵詞：中藥提取物;禽多殺性巴氏桿菌;抑菌作用
　　中圖分類號：S859.3;R282.71         文獻標識碼：A
　　文章編號：0439-8114（2019）07-0089-03
　　Abstract： The experiment was conducted to explore the inhibition effect of magnolol，palmatine，cortex fraxini，emodin and cortex phellodendri on avian Pasteurella multocida C48-1 determined by disk diffusion method and double dilution method. The results of vitro antibacterial effect indicated that the diameter of inhibition zone of magnolol，palmatine，cortex fraxini were 22.0，11.3，15.6 mm，and the MIC were 8，256，64 μg/mL，and the MBC were 16，512，256 μg/mL，respectively. Emodin and cortex phellodendri had no antibacterial effect on P.multocida C48-1. Magnolol had the strongest antibacterial effect， followed by cortex fraxini，and palmatine had the weakest antibacterial effect on P.multocida C48-1. When P.multocida C48-1 were cultured in the content that magnolol was 6 μg/mL，the growth rate was significantly inhibited compared with the control group. P.multocida C48-1 won’t be completely inhibited until the magnolol’s content reached 8 μg/mL. According to the results of vivo antibacterial effect， the protective rate of magnolol was up to 50% when Jianghan chickens was infected by P. multocida C48-1. This study also provides an important basis for further studying to protect avian P. multocida disease.
　　Key words： extracts of traditional Chinese medicine; avian Pasteurella multocida; antibacterial effect
　　禽多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）為無芽孢、不運動、兼性厭氧、菌體兩端常染色濃重的革蘭氏陰性小桿菌[1]。在動物養殖業中，禽多殺性巴氏桿菌可使雞發生禽霍亂，導致養殖戶嚴重的經濟損失[2]。目前主要采用抗生素防治禽多殺性巴氏桿菌，但抗菌藥物的不合理應用，特別是將抗菌藥物作為抗菌生長促進劑添加到飼料中，使巴氏桿菌表現為耐藥率高、耐藥范圍廣、呈多重耐藥等特點，而且加劇了抗生素在動物體內的殘留，嚴重危害了動物食品安全[3，4]。中藥具有抗菌消炎、無殘留、不易產生耐藥性等優點。中藥的使用可以降低抗生素類藥物殘留，減少耐藥性[5]。國內外文獻報道，未見有對禽多殺性巴氏桿菌有較好抑菌效果和保護效果的中藥。
　　試驗采用藥敏紙片法、微量肉湯稀釋法對厚樸酚、黃藤素、大黃素、秦皮和黃柏等中藥提取物對禽多殺性巴氏桿菌C48-1的體外抑菌作用進行檢測，同時對抑菌效果較好的厚樸酚進行體內抑菌試驗，旨在找到有較強抑菌作用、能夠防治禽霍亂的中草藥制劑。
　　1  材料與方法
　　1.1  菌株與主要試劑
　　禽多殺性巴氏桿菌（C48-1）菌株購于中國獸醫藥品監察所，TSA、TSB培養基購自美國BD公司，MH肉湯培養基購自青島海博生物技術有限公司，聚乙二醇400購自索萊寶科技有限公司，厚樸酚、秦皮、黃藤素、大黃素和黃柏提取物由湖北省農業科學院中藥材研究所提供。 　　1.2  主要儀器設備
　　37 ℃恒溫培養箱（黃石市恒豐醫療器械有限公司），微量紫外-可見光分光光度計（NanoDropTMOneC），超聲波清洗機（墨潔S3000），精密分析天平。
　　1.3  中藥藥液的制備
　　將中藥稱量少許溶于50% PEG400中，用超聲波振蕩助溶，再用0.22 μm濾膜過濾，使藥液濃度相當于4 096 μg/mL，4 ℃保存，備用。
　　1.4  單味中藥提取物抑菌圈直徑的測定
　　將濾紙片用直徑6 mm打孔器打成圓片，120 ℃干熱滅菌2 h。在無菌條件下，將紙片放入中藥藥液中，室溫浸泡2 h，用培養皿干燥法干燥，4 ℃保存備用。以MH培養基培養新鮮的禽多殺性巴氏桿菌C48-1，使OD600 nm值在0.5左右，將菌液均勻涂布于MHA平板上，待干燥后將中藥藥敏紙片均勻分布于瓊脂表面，每個平板3次重復，37 ℃培養24 h后用直尺測量抑菌圈直徑。
　　1.5  單味中藥提取物最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）的測定
　　取菌液50 μL分別加入含有不同濃度中藥的肉湯培養基中，肉湯培養基中中藥的濃度自第1孔開始依次倍比釋釋至第11孔，第12孔不加中藥提取液，作為空白對照。每孔肉湯培養基和藥液各50 μL，
　　37 ℃培養24 h后取出，觀察細菌生長情況，與濁度對照組比較，以肉眼觀察無細菌生長的最低濃度判定為中藥的最小抑菌濃度MIC值。將上述中藥組中的細菌被完全抑制的管中液體取100 μL接種涂布于MH瓊脂培養基平板上，經37 ℃培養24 h后觀察結果。以肉眼觀察菌落不生長視為100%被殺滅，此最低藥物濃度值為其最小殺菌濃度MBC值。
　　1.6  生長曲線的測定
　　劃線接種禽多殺性巴氏桿菌C48-1，挑單菌落接種于10 mL新鮮TSB培養基中，37 ℃，220 r/min搖床過夜培養，按1%的接種量接種于TSB培養基，添加厚樸酚藥液使厚樸酚終濃度分別為0、2、4、6、8 μg/mL，每隔1 h測定一次OD600 nm值，繪制生長曲線。
　　1.7  厚樸酚體內抑菌試驗
　　購置60只50～60日齡江漢雞，分為4組;第一組、第二組和第三組給藥劑量按每千克體重2.5 mg拌服料喂，分別為143 mg/（只·d）、286 mg/（只·d）和429 mg/（只·d）;第四組為對照組（不添加任何藥物）。再從-80 ℃冰箱復蘇禽多殺性巴氏桿菌C48-1菌株，10倍稀釋8個梯度，攻毒經飼喂7 d的江漢土雞，并將攻毒菌液涂布TSA進行平板計數，觀察雞只健康情況，記錄試驗結果。
　　2  結果與分析
　　2.1  單味中藥提取物抑菌圈直徑大小
　　5種中草藥提取物對禽多殺性巴氏桿菌C48-1的抑菌圈大小見表1。從表1可以看出，厚樸酚、黃藤素和秦皮對禽多殺性巴氏桿菌C48-1均有一定的抑菌作用，其中厚樸酚的抑菌效果最佳;大黃素和黃柏提取物對禽多殺性巴氏桿菌C48-1沒有抑菌效果。
　　2.2  單味中藥提取物最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）
　　厚樸酚、黃藤素和秦皮的MIC、MBC結果見表2。從表2可以看出，厚樸酚對禽多殺性巴氏桿菌C48-1的MIC為8 μg/mL，MBC為16 μg/mL;黃藤素的MIC為256 μg/mL，MBC為512 μg/mL;秦皮的MIC為64 μg/mL，MBC為256 μg/mL;因此，后續選擇抑菌和殺菌效果最好的厚樸酚進行體內抑菌試驗。
　　2.3  厚樸酚對禽多殺性巴氏桿菌增殖的影響
　　由圖1可以看出，加入厚樸酚為6 μg/mL時，細菌的生長速度相比對照組受到明顯抑制，在第2～8小時恢復生長，但總體比對照組慢很多。最終OD600 nm最大值均接近1.5，說明厚樸酚能減緩禽多殺性巴氏桿菌C48-1的生長，但不影響生長極限。當藥物濃度為MIC值（8 μg/mL）時，OD值為一條水平直線，禽多殺性巴氏桿菌C48-1生長被完全抑制。
　　2.4  厚樸酚對禽多殺性巴氏桿菌C48-1的體內抑菌結果
　　由平板計數結果得知，禽多殺性巴氏桿菌C48-1對江漢雞的攻毒量為50 CFU。由表3可知，添加厚樸酚的試驗組存活率高于對照組，且隨著中藥劑量的增加，保護率由第一組的10%提高到第二組的50%，繼續增加厚樸酚劑量，保護率穩定在50%不再增加，說明厚樸酚對江漢雞體內感染禽多殺性巴氏桿菌C48-1有一定的保護作用，但不能達到完全抑菌。
　　3  小結與討論
　　禽霍亂是由禽多殺性巴氏桿菌引起的接觸性敗血性傳染病，感染后發病率快，死亡迅速，死亡率高。中藥作為抗生素的良好替代物，在禽病防治中逐漸得到應用[6]。本試驗發現，厚樸酚、黃藤素對革蘭陰性菌禽多殺性巴氏桿菌C48-1有抑菌活性，其中厚樸酚抑菌效果較強。這與牛國一等[7]報道的結果一致。李輝明[8]研究表明了牛致病性巴氏桿菌對秦皮和蒲公英兩種藥物低度敏感，這與本試驗中秦皮對禽多殺性巴氏桿菌有中度抑菌效果基本一致。
　　中藥的不同提取部位抑菌活性不同，大多數中藥的有效提取物對細菌、病毒等都有一定的抑制作用。張海暉等[9]報道了大黃提取物大黃素對禽巴氏桿菌的抑菌圈為12.02 mm，MIC為28.13 μg/mL。曲徑等[10]研究發現，黃柏、艾葉、黃連、地榆有效部位提取物對巴氏桿菌的MIC為7.8 mg/mL。常超越等[11]發現雞源多殺性巴氏桿菌對黃柏高度敏感。這與本試驗的結果存在差異，可能是由于中藥提取方法和工藝不同，得到的有效成分和純度不同，從而導致抑菌結果存在差異。
　　厚樸酚對禽多殺性巴氏桿菌的生長曲線顯示，當厚樸酚濃度≤1/2 MIC時，禽多殺性巴氏桿菌活性部分被抑制，添加厚樸酚試驗組比對照組進入對數期時間推遲，但厚樸酚不影響細菌的生長極限;當厚樸酚濃度在1/2 MIC～MIC時，禽多殺性巴氏桿菌活性明顯被抑制;謝麗玲等[12]研究黃芩醇對副溶血性弧菌的抑制機制時，也發現了添加中藥后細菌進入對數期時間被延長。厚樸酚體內抑菌試驗結果表明，江漢雞在連續添加不同劑量厚樸酚的飼料飼喂7 d后，用禽多殺性巴氏桿菌C48-1攻毒，飼喂劑量從143 mg/（只·d）增加到286 mg/（只·d），保護率從10%增長到50%，進一步增加中藥劑量，保護率不再上升，可能與雞只對中藥的吸收和代謝相關。 　　目前，中藥替代抗生素進行禽病防控的需求越來越大，中藥富含多種活性的化學抗菌物質，但是中藥的抗菌機理尚未研究明確，有待進一步研究。本研究為進一步研發中藥制劑預防禽多殺性巴氏桿菌病提供了一定的理論基礎。
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