霜疫霉侵染后荔枝果皮結構變化的掃描電鏡觀察
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摘 要 霜疫霉病嚴重危害荔枝果實的產量和質量，其病原菌是霜疫霉（Phytophthora litchii Chen ex Ko et al.）。以4×104 cfu/mL霜疫霉孢子懸浮液分別接種抗病品種‘黑葉’和感病品種‘桂味’的果實，通過掃描電子顯微鏡觀察接種0、1、6、12、24、48、72、96 h后荔枝外果皮顯微結構的變化。掃描電鏡觀察發現，‘黑葉’果皮的龜裂片平整，主要組成單元為微小乳突狀結構，其中間微微凸起且結構致密緊實;‘桂味’果皮的裂片谷較深，主要組成單元為微小蜂窩狀結構，其中間凹陷且壁薄挺立。隨著貯藏時間的延長，2個品種外果皮均出現不同程度的損傷，但‘黑葉’比‘桂味’損傷較輕。用相同濃度霜疫霉孢子接種后，‘桂味’果皮附著孢子的數量是‘黑葉’的近5倍，說明‘桂味’果皮顯微結構更易于霜疫霉孢子的附著和侵染。接種霜疫霉后，病原菌侵染加劇荔枝外果皮結構的崩解，但‘黑葉’外果皮崩解速度較慢。在‘黑葉’上霜疫霉的孢子萌發、菌絲生長和孢子囊形成都晚于‘桂味’，說明其對霜疫霉的生長有一定的抑制作用?！谌~’和‘桂味’果皮顯微結構的差異是其對霜疫霉表現不同抗性的重要原因。
關鍵詞 荔枝;霜疫霉;外果皮結構;掃描電子顯微鏡
中圖分類號 S436.67+1 文獻標識碼 A
Abstract Litchi downy blight is a damaging oomycete disease， caused by Phytophthora litchii. The 4×104 cfu/mL sporangium suspension was used to inoculate the fruit of the resistant cultivar ‘Heiye’ and susceptible cultivar ‘Guiwei’. The ultra-structural changes of exocarps was investigated by the Scanning Electron Microscopy （SEM） method at 0， 1， 6， 12， 24， 48， 72， and 96 h post-inoculation. The results indicated that the lobe of exocarp was flat and consisted of convex and compact honeycomb in ‘Heiye’， while the valley of lobe was deep， and the honeycomb was thin and erect in ‘Guiwei’. The integrity of exocarps was damaged with the prolonging of the harvest time. The infection of P. litchii promoted the dissociation of exocarps， as well as the damage degree of ‘Hieye” was lower than that of ‘Guiwei’. Under the same inoculation condition， the exocarps of ‘Guiwei’ harbored nearly five times sporangia than that of ‘Heiye’. The character of lobe and honeycomb was more easily agglutinated and infected by the spores of P. litchii in ‘Guiwei’. The infection of P. litchii accelerated the breakdown of exocarp structure， which had a small impact on ‘Heiye’. Comparing with ‘Guiwei’， the gemination of spores， as well as growth of mycelium and formation of sporangia， was lagging in ‘Heiye’. It is suggested that the growth of P. litchii is repressed in the exocarps of resistant cultivars. The structure difference of the exocarp is the reason why ‘Guiwei’ is more susceptible to P. litchii than ‘Heiye’.
Keywords litchi; Phytophthora litchii; structure of exocarp; scanning electron microscopy
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.016
荔枝（Litchi chinensis Sonn.）原產于中國南部和越南北部，是我國熱區重要的特色水果[1]。荔枝霜疫霉?。↙itchi downy blight）由霜疫霉菌（Phytophthora litchii Chen ex Ko et al.）引起，是荔枝生產上的主要病害之一。該病主要危害荔枝近成熟果實，引發大量的裂果、落果和爛果，降低果實產量和品質[2-8]。目前，荔枝霜疫霉病的防治主要通過施用化學藥劑，如大生、代森錳鋅和甲霜靈等。雖然藥劑防治效果較好，但長期大量施用對生態、環境和食品安全都造成了一定程度的影響。利用植物自身的抗病性防治病蟲害，不僅綠色環保，而且高效安全?？剐詸C制的研究能為培育抗性品種奠定理論基礎。 果實表皮是抵御病原菌侵染的第一道屏障，在芒果、龍眼、蘋果、鴨梨和油茶等果樹中證實了其結構與抗病性緊密相關[9-20]。關于荔枝的果皮結構，已有學者開展了一些研究。荔枝果皮由外、中、內三層組成，其外表面有龜裂片。通過觀察比較不同荔枝品種的表皮結構，彭永宏等[21]發現品種間果皮結構差異明顯。具體表現為：一部分荔枝品種的龜裂片突起較明顯且排列不整齊，而另一部分品種龜裂片較平整、突起小且排列整齊。潘洵操和胡新宇等[22-23]用電子顯微鏡觀察發現，荔枝外果皮由半球狀突起物組成，其表面分布著不規則的蜂窩狀坑洼。朱若馨[24]觀察到荔枝果皮的表面由很多低谷和嵴峰構成，果皮表面分散著微小裂口。不同荔枝品種的果皮顯微結構存在差異，且與其果實抗病性有一定的關系。通過霜疫霉孢子接種‘陳紫’果實，蔡學清等[25]利用掃描電鏡初步研究了霜疫霉侵染荔枝果皮的過程。
雖然荔枝果皮結構已有一些研究進展，但果皮顯微結構與其對霜疫霉病抗性之間的關系尚未見報道。前期研究發現，不同荔枝品種果實對霜疫霉病表現不同的抗性。其中，‘黑葉’在多個年份對霜疫霉病表現穩定抗病性，而‘桂味’則表現穩定感病性[26]。本研究在此基礎上，利用體式顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察比較‘黑葉’與‘桂味’果皮顯微結構差異，分析接種霜疫霉對其果皮顯微結構的影響，以期闡明荔枝果皮顯微結構與其對霜疫霉抗性之間的關系。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 荔枝材料 采摘‘黑葉’（抗病品種）和‘桂味’（感病品種）約八成熟果實[26]，4 h內運回實驗室。挑選成熟度相對一致、大小均一、無病蟲害和機械損傷的果實。先用自來水沖洗干凈，再用無菌去離子水沖洗2遍，自然晾干（約10 min左右）后立即用于接種處理。
1.1.2 霜疫霉菌株 菌株為本實驗室從荔枝品種‘三月紅’病果上分離，經形態學和分子生物學鑒定其為霜疫霉后純化并保存。接種前活化菌株，然后在28 ℃，10% V8培養基上培養7～9 d，收集孢子囊用于荔枝果實接種處理。
1.2 方法
1.2.1 孢子囊懸浮液配制 參照曹璐璐等[26]的方法，在霜疫霉培養皿中加入10 mL無菌水，浸泡菌絲10 min后用雙層無菌紗布過濾收集孢子。顯微鏡觀察計算孢子囊數量，并調整孢子囊濃度為4×104 cfu/mL。
1.2.2 果實接種 參照曹璐璐等[26]的方法，將自然晾干的果實置于4×104 cfu/mL孢子囊懸浮液中浸泡5 min，取出后稍稍瀝干水分，放置在底部鋪有雙層吸水紙的保鮮盒中（預先用無菌水潤濕以保持濕度）。浸泡5 min無菌水的荔枝果實作為對照組。果實單層擺放，相互之間無擠靠。蓋緊保鮮盒，28 ℃恒溫放置。20個果實作為一次重復，每個處理重復3次。
1.2.3 掃描電鏡樣品制備和觀察 果實接種霜疫霉0、1、6、12、24、48、72、96 h后，首先用鑷子撕取果實縫合線兩側部位的果皮，然后病斑部位用雙面刀片切取成3 mm×3 mm大小的方塊（對照組做同樣處理）。參照李和平[27]的方法制備掃描電鏡樣本并稍有改動，其改動處為分別用丙酮∶醋酸異戊酯按照3∶1、1∶1、1∶3與純醋酸異戊酯進行置換，其他步驟相同。樣品制備后通過掃描電子顯微鏡（ZEISS EVO18）觀察果皮顯微結構的變化。
1.2.4 外果皮結構參數測量 荔枝果皮結構參數如下：
裂片峰高度（Peak hight， H1）：裂片峰到內果皮的距離（圖1A，圖1F）。
裂片谷厚度（Valley hight， H2）：裂片谷中央到內果皮的距離（圖1A，圖1F）。
龜裂片半徑（Protuberance radius， R）：從裂片峰到裂片谷邊緣的距離（圖1B，圖1G）。
裂片谷寬度（Valley width， W）：相鄰龜裂片間的距離（圖1B，圖1G）。
果皮厚度（Pericarp thickness， T）：鄰接裂片峰高度和裂片谷厚度的平均值（T=H1/2+H2/2）。
孢子附著密度（Density of sporangia， D）：接種霜疫霉1 h后每平方厘米果皮附著的孢子囊、次生孢子囊和孢子的總和。
其中，H1和H2值為在體視顯微鏡（ZEISS V12）下測量的數值，R和W值在掃描電鏡下測量。每個值測量25個樣本，最終計算平均值。D值為掃描電鏡下觀察記錄每個視野的孢子數，共記錄200個視野，換算成單位面積附著孢子數并取整。
1.3 數據分析
實驗數據采用Excel軟件和DPS數據處理系統[28]進行統計分析。
2 結果與分析
2.1 ‘黑葉’和‘桂味’果皮的顯微結構觀察
荔枝果皮由外、中、內3層組成?！谌~’和‘桂味’的外果皮為柵狀組織，含有豐富的花色素苷，因而較中果皮和內果皮的顏色更深（圖1A，圖1F）。外果皮由龜裂片和連接緊鄰龜裂片的裂片谷組成（圖1B，圖1G）。兩個品種的裂片谷都較為平滑（圖1C，圖1H）。龜裂片可分為三個部分：裂片峰、從裂片峰向下發散的條狀脊背和除這兩者之外的其他區域（圖1B，圖1G）。‘黑葉’的龜裂片比較平滑，裂片峰微尖（圖1A，圖1B）;‘桂味’的龜裂片隆起明顯，裂片峰呈楔形（圖1F，圖1G）。兩個品種龜裂片的脊背都由微小的突起結構組成，排列整齊（圖1D，圖1I）。與‘桂味’相比，‘黑葉’脊背的突起面積較小，而且凸起不明顯（圖1B，圖1G）。其它區域是龜裂片的主體部分，占龜裂片面積的90%以上，也由類似的微小單元結構組成?！谌~’的其他區域由類似脊背的乳狀突起組成，其結構比較致密，中間凸起，突起間排列緊實（圖1E）?！鹞丁钠渌麉^域由微小的蜂窩狀結構組成，其排列比較稀疏，中間凹陷，連接每個凹陷的壁比較薄且挺立（圖1J）。 ‘黑葉’和‘桂味’的龜裂片半徑（R）分別為2085.6、1440.5 μm（表1），兩者的比值為1.45?！谌~’的裂片峰高度（H1）為576.8 μm，不及‘桂味’裂片峰高度的三分之二（表1）。綜合考慮龜裂片半徑和裂片峰高度，相同投影面積‘桂味’果皮比‘黑葉’具有更大的實際面積?！谌~’ 的裂片谷寬度（W）也顯著小于‘桂味’，而兩者的果皮厚度差異不顯著（表1）。‘桂味’每平方厘米（投影面積）的果皮附著5077個孢子，幾乎是‘黑葉’的5倍（表1）。接種霜疫霉后，孢子和孢子囊大部分吸附在裂片谷、乳突結構（黑葉）連接處或蜂窩狀結構（桂味）的凹陷里（圖2C1～圖2C3，圖2D1～圖2D4）?！鹞丁啾取谌~’果皮的裂片谷深且寬，更易與孢子和孢子囊的吸附。另外，‘桂味’外果皮的蜂窩狀結構非常適合孢子和孢子囊的附著（圖2D3）。
2.2 采后‘黑葉’和‘桂味’外果皮結構的變化
在0～48 h時，‘黑葉’對照果實的外果皮未觀察到損傷，其結構完整（圖2A1～圖2A6）;在72 h時，觀察到龜裂片的部分突起開始塌陷，果皮開始出現損傷（圖2A7）;在96 h時，龜裂片的突起塌陷加重（圖2A8）。在0～12 h時?！鹞丁瘜φ展麑嵉姆涓C狀結構褶皺明顯而且完整，未發現損傷（圖2B1～圖2B4）;在24 h時，蜂窩狀結構的褶皺變得模糊，開始趨于平滑（圖2B5）;在48 h時，觀察到龜裂片部分凸起的壁出現缺口，開始出現損傷（圖2B6）;在72 h時，部分蜂窩狀結構被破壞（圖2B7）;在96 h時，蜂窩狀結構破壞更加嚴重，凸起的薄壁崩解成碎片（圖2B8）。
2.3 霜疫霉侵染荔枝果實及其對外果皮結構的影響
‘黑葉’接種霜疫霉后，在0～12 h時，觀察到其外果皮上附著有孢子和孢子囊（圖2C1～圖2C4）;在24 h時，附著的孢子囊延伸出菌絲，且貼著表面生長（圖2C5）;在48 h時，菌絲從乳突結構的間隙侵入中果皮（圖2C6）;在72 h時，侵入中果皮內的菌絲開始向四周發散延伸（圖2C7）;在96 h時，侵染成功的菌絲體形成二指叉狀孢囊梗和成熟的孢子囊（圖2C8）?！鹞丁臃N霜疫霉后，在0～6 h時，觀察到孢子附著在龜裂片的蜂窩狀結構中，且6 h時孢子開始萌發（圖2D1～圖2D3）;在12 h時，在裂片谷中發現貼壁延伸的菌絲（圖2D4）;在24 h時，侵入到中果皮內的菌絲開始呈發散狀延伸（圖2D6）;在48 h時，有大量的菌絲體緊貼外果皮表面向四周發散狀延伸（圖2D6）;在72 h時，成熟的菌絲體交織在外果皮表面，并觀察到少量散落的成熟孢子囊（圖2D7）;在96 h時，菌絲體布滿果實表面，形成大量散落的成熟孢子囊（圖2D8）。
霜疫霉的孢子囊呈檸檬形，與其侵染荔枝外表皮后形成的成熟孢子囊相同（圖2C2，圖2C5，圖2C8，圖2D7～圖2D8）。孢子囊生長形成的營養體為無隔菌絲，孢囊梗呈多級有限生長（圖2C5，圖2C7，圖2C8，圖2D5～圖2D8），與前人的研究結果相同[8， 22-24]。霜疫霉孢子囊接種‘黑葉’和‘桂味’果實后有2種侵染方式：（1）孢子囊首先釋放游動孢子，然后游動孢子依靠鞭毛移動到合適的位點并吸附到果皮的表面，接著萌發并從外果皮的嵴點裂縫處侵入，隨后在侵入點生長出菌絲，菌絲擴張并形成孢子囊，進而進行第二輪的侵染（圖2C4，圖2C6）;（2）附著在外果皮的孢子囊直接萌發出菌絲，菌絲緊貼外果皮表面進行延伸，破壞果皮結構（圖2C5）。這兩種侵染方式可以通過菌絲生長方式進行區分，前一種的菌絲呈發散狀向外延伸（圖2C5，C7，圖2D5～6），而后一種是貼著外果皮表面進行生長（圖2C6，圖2D4，圖2D7）。
在0～1 h時，‘黑葉’接種霜疫霉和對照的外果皮結構一樣完整，龜裂片的乳突結構凸起明顯（圖2A1，圖2C1）;在6 h 時，龜裂片的乳突結構的凸起部分出現損傷（圖2C3），而對照果皮的乳突結構直到72 h才觀察到損傷（圖2A7）;其后隨著霜疫霉侵染時間的延長，‘黑葉’果皮的損傷越來越嚴重（圖2C4～圖2C6，圖2C7～圖2C8）。在0～1 h時，‘桂味’接種霜疫霉與對照相比，外果皮結構沒有明顯的區別; 在6 h時，外果皮的蜂窩狀結構的凸起部分有損傷開始塌陷（圖2D3），較對照出現相似的損傷提前42個小時（圖2D3）;其后隨侵染時間的延長果皮損傷越發嚴重，直至96 h時完全崩解。霜疫霉的侵染同時加劇了抗、感病品種果皮顯微結構完整性的崩解，但抗性品種的崩解速度相對較慢。
3 討論
荔枝果皮龜裂片和裂片峰形態（突起或者平滑）是較為穩定的遺傳性狀，是品種分類的一個主要依據?！谌~’的龜裂片平整，裂片峰微尖;而桂味的龜裂片隆起非常明顯，裂片峰尖銳。二者間龜裂片微觀上的差異反映在觸感上‘桂味’較為刺手?？?、感病品種間，龜裂片半徑和裂片峰高度都存在顯著差異。感病品種‘桂味’不僅具有較小的龜裂片半徑，而且裂片峰較高，導致其相同投影面積果皮比‘黑葉’具有更大的表面積。接種相同濃度的霜疫霉，‘桂味’較‘黑葉’能吸附更多的孢子和孢子囊。數據顯示，‘桂味’果皮吸附的孢子數量近‘黑葉’的5倍。與‘黑葉’相比，‘桂味’果皮能吸附較多的霜疫霉孢子，這是‘桂味’對霜疫霉病表現感病的原因之一。
‘黑葉’果皮的龜裂片主要由微小的乳突狀結構單元組成，其排列緊致。‘桂味’的龜裂片主要由微小的蜂窩狀結構單元組成，連接各個蜂窩孔之間的壁薄且挺立。潘洵操和胡新宇等[22-23]發現荔枝外果皮由許多半球形突起物構成，突起物表面有條狀角質層或蠟被，表面有許多不規則的坑洼呈蜂窩狀。彭永宏等[21]觀察表明，龜裂片較平整的品種，如‘黑葉’和‘糯米糍’，其小突起排列較整齊;龜裂片突起較明顯的品種，如‘桂味’和‘禾蝦串’，其小突起排列不整齊。這些研究都與本實驗結果一致。需要注意的是，抗、感病品種間果皮龜裂片組成單元結構迥異。‘黑葉’的組成單元為乳突狀結構，其中間向外凸起;而‘桂味’的組成單元為蜂窩狀結構，其中間向內凹陷。組成單元的結構差異對荔枝的抗病性有直接的影響。 霜疫霉孢子在‘黑葉’中主要吸附在乳突狀結構凸起的連接處，孢子數量較少;而‘桂味’中主要吸附在蜂窩狀結構的凹陷中，孢子數量較多。蜂窩狀結構較乳突狀結構更利于孢子的吸附。不僅如此，24 h時‘桂味’果皮的顯微結構開始崩解，而‘黑葉’中直到72 h才觀察到損傷，說明乳突狀結構比蜂窩狀結構有更強的抵御損傷的能力。接種霜疫霉6 h后，在兩個品種的果皮結構都觀察到損傷，霜疫霉侵染破壞了荔枝外果皮顯微結構的完整性，加劇了果皮的損傷程度?！谌~’乳突狀結構的排列較為緊密，連接處的凹陷較淺，病原菌侵染穿透果皮的難度較大?！鹞丁涓C狀結構的壁較薄，中間的凹陷較深，病原菌能很容易的穿透果皮。乳突狀結構和蜂窩狀結構的差異是抗、感病品種抗性差異的另一個重要原因。
霜疫霉侵染荔枝果實有兩種方式：一是釋放游動孢子從果皮裂縫侵入內果皮，菌絲發散生長并形成孢子囊;二是孢子囊直接萌發形成菌絲，菌絲緊貼外果皮表面生長。蔡學清等[25]發現，霜疫孢子囊聚集在接種果皮的嵴點裂縫處，一部分萌發成芽管直接從果皮嵴點裂縫處和皮孔侵入，另一部分釋放游動孢子，游動孢子再萌發形成芽管從果皮的嵴點裂縫處侵入。兩種侵染方式本研究中都觀察到，由于技術原因未能判斷哪種方式為主要的侵染形式，留待下一步的研究。接種霜疫霉6 h后，‘桂味’果皮表面觀察到孢子的萌發，而在‘黑葉’中未見，‘黑葉’中霜疫霉孢子的萌發時間較晚。接種24 h時，兩個品種的果皮表面都已長出菌絲;48 h時，菌絲體已侵入內果皮，隨后菌絲體大量生長。霜疫霉在‘黑葉’果皮形成孢子需要96 h，生成的孢子囊較少;在‘桂味’果皮上僅72 h就能形成的孢子囊，時間較短。兩品種間霜疫霉侵染過程存在一定的差異，主要為在‘黑葉’果皮表面霜疫霉的孢子萌發、菌絲生長和孢子囊的形成要滯后于‘桂味’。抗病品種‘黑葉’對霜疫霉生長的抑制是其表現抗性的原因之一。
4 結論
通過顯微觀察荔枝抗、感病品種果皮結構，發現抗性品種‘黑葉’果實具有較小的比表面積，外果皮組成單元主要為乳突狀結構，其排列緊致;而感病品種‘桂味’果實具有較大的比表面積，外果皮組成單元主要為蜂窩狀結構，其排列稀疏。隨著時間的延長，荔枝采后果皮結構會出現一定程度的損傷，而霜疫霉菌的侵染加劇了這一過程。荔枝外果皮的微觀結構與其對霜疫霉病的抗性緊密相關。一方面，‘黑葉’較小的比面積導致較少的霜疫霉孢子吸附;另一方面，‘桂味’稀疏排列的蜂窩狀結構利于霜疫霉孢子從縫隙處侵染果實。加之抗性品種‘黑葉’對霜疫霉的孢子萌發、菌絲生長和孢子形成具有抑制作用，導致‘黑葉’和‘桂味’對霜疫霉菌的侵染表現不同的抗性。荔枝外果皮結構特征可作為鑒定果實對霜疫霉病抗性的重要依據，在荔枝抗病育種中加以應用。
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