稻曲病侵染規律研究進展與展望

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　　摘要：水稻稻曲病（Rice false smut，RFS）發生情況日趨嚴重，已經上升為水稻主要病害之一。目前對稻曲病的研究已經取得一定的進展，但對其病菌侵染方式和侵染機理的了解還有局限性。通過激光共聚焦和透射電鏡等方法已經基本明確了稻曲病菌在穎花內的侵染過程，然而稻曲病是否具有系統侵染、種子帶菌以及幼苗根部侵染對病害發生的影響程度仍有待明確。對稻曲病菌研究中存在的亟待解決的問題進行了探討分析，同時也對稻曲病主要的防控手段和病原監測方法進行了總結。
　　關鍵詞：稻曲?。≧ice false smut，RFS）;侵染方式;侵染機制;活體寄生
　　中圖分類號：S432.1         文獻標識碼：A
　　文章編號：0439-8114（2019）09-0005-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.001           開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：
　　Abstract： Rice false smut has become one of the most severe rice disease in China. At present， some progress has been made in the study of rice false smut. There are still some puzzles about infection site and infection mechanism in Villosiclava virens. Laser confocal microscopy and transmission electron microscopy （TEM） have helped to provide the specific description of infection process of rice false smut in spikelet. However， there were no molecular evidence about the contribution of systemic infection， seedling and seed infection in life cycle. The problems existing in the research of rice false smut were discussed and analyzed. At the same time， the main methods of prevention and control of rice false smut and the methods of pathogen surveillance were summarized.
　　Key words： rice false smut; infection site; infection mechanism; biotrophic infection
　　水稻稻曲?。≧ice false smut，RFS）是由子囊菌門稻曲病菌（Villosiclava virens）引起的[1]，其無性世代為Ustilaginoidea virens。近年來稻曲病流行情況日趨嚴重，與稻瘟病、紋枯病并稱水稻新三大病害，據統計中國有1/3的水稻產區都受到稻曲病的危害[2]。
　　稻曲病菌在破口前侵染水稻穗部，而后通過吸收水稻穎殼內的營養快速生長最終膨大形成稻曲球，成熟的稻曲球由內部質密的菌絲和外部覆蓋大量墨綠色厚垣孢子組成。特定條件下，稻曲球上可形成菌核。據統計在溫帶和亞熱帶地區攜帶菌核的稻曲球比例大約在2.1%～15.0%，菌核形成大都在10月至11月初[3]。厚垣孢子在田間能夠存活超過4個月，而菌核則能夠存活時間更久，成熟的菌核需要2～5月的休眠期才能分化形成子實體[3]，子實體成熟后釋放子囊孢子，厚垣孢子及子囊孢子都能夠成為第二年的初侵染源。此外，稻曲球中富含稻曲菌素（ustiloxins）和稻核黑粉菌素（ustilaginoidins）兩類真菌毒素[4，5]。稻曲病的流行發生不僅會對稻米的產量和品質造成嚴重影響，而且其產生的稻曲病菌毒素對人和生畜都有毒性。
　　化學防治是稻曲病防控的主要手段。研究表明穗苞破口前4～15 d是藥劑防治的主要時期，其中前4～7 d防治效果最佳[6]。播種前種子處理也可以有效控制稻曲病。有報道不同的水稻品種對稻曲病的抗感水平存在差異[7，8];Han等[9]通過RNA-Seq比較了抗病品種IR28和感病品種LVP9在病菌侵染初期基因表達動態的差異。然而目前仍然沒有主效抗病基因被鑒定，數量性狀位點（QTLs）的報道也比較少[10，11]。稻曲病抗病機理研究仍處于起步階段，抗病種質資源仍然缺乏。
　　近年來稻曲病發病情況日趨嚴重，研究熱度也在增加。但由于稻曲病菌生物學性狀特殊，導致研究存在一定的困難，所以進展也相對較緩慢。本文從稻曲病病害侵染規律角度對稻曲病相關研究進行總結和展望。
　　1  稻曲病病源種群鑒定與監測
　　田間稻曲病菌種群的監測有利于病害發生的預測預報。有學者通過基因組DNA指紋圖譜技術對稻曲病菌種群進行分析，發現群體分布與地理區域之間關系顯著， 推測其傳播流行具有區域性[12]。Wang等[13]對來自湖北省的153個菌株分析，證實了地區對種群的影響多于水稻品種的影響。以上種群分布的研究結果為稻曲病區域防控提供了理論基礎。菌株分離有兩種主要方法，分別是厚垣孢子懸液法和組織塊分離法[14]。采用厚垣孢子分離方法，鮮黃色稻曲球平均分離成功率超過90%，墨綠色的厚垣孢子則無法成功分離[15]。此時的厚垣孢子已經進入休眠狀態，日常狀態下不易萌發，所以對于厚垣孢子已進入休眠或者稻曲球保存時間較久的情況，火焰灼燒組織分離法更有效。經過驗證使用75%乙醇浸潤后再用火焰灼燒，最后使用升汞消毒40 s分離效果最好[14]。雖然稻曲病菌是活體營養型，但其也能夠在培養基上生長，屬非專性寄生。在以蔗糖為糖源的培養基中生長最好，并且蔗糖含量為2%～3%最佳。缺乏氮素的條件下不能生長，氮、鉀、鋅缺乏則生長情況較差。放置在黑暗條件下生長狀況較好，菌絲生長溫度為10～30 ℃，最適生長溫度為28 ℃[16]。 　　除了使用傳統的分離鑒定方法對菌源進行監測外，新型的分子生物學手段具有靈敏度高、檢測周期短等優點。Zhou等[11]通過比較多個不同菌株之間的ITS1、ITS2和5.8s rRNA序列設計了能夠檢測稻曲病菌的特異引物。Chen等[17]利用稻曲病菌5.8S核糖體DNA設計的特異引物檢測了24個水稻樣本，其中9個樣品呈陽性，污染率達37.5%。為了檢測土壤中微量的稻曲病菌樣本，有學者根據核糖體DNA開發基于Real-time PCR技術的特異引物。通過檢測比較發現Real-time PCR檢測靈敏度比傳統PCR和巢氏PCR高100倍以上[18]。但是基于PCR檢測方法均需要相關試驗設備，操作步驟相對復雜，反應時間較長。Yang等[19]開發了一種基于環介導等溫擴增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）的快速檢測技術，這種方法具有反應時間短、操作簡便、特異性強和靈敏度高的特點。對于田間種子檢測只需要用無菌水浸透種子，將浸出液體取10 μL加入到含有反應試劑的離心管中，將離心管放置到65 ℃恒溫水浴鍋1 h，80 ℃加熱10 min即可終止反應。此時即可通過HNB或者SYBR green I染料的顏色變化觀察反應結果。這種方法為田間實地監測提供了便利，降低了病原菌檢測的成本。
　　對于病原菌致病力的測定，因為侵染位點和侵染方式的特殊性，稻曲病采用水稻穗部注射的方法接種。在20世紀接種技術研究的早期，外國學者最先采用的方法是厚垣孢子噴霧接種。杜毅等[20]首次報道使用分生孢子注射接種水稻穗苞的方法，經過不斷改進該接種方法已經可以達到穗發病率100%。抽穗破口前6～9 d，16：00～18：00時段，注射由PS培養基配制的分生孢子菌絲混合液，分生孢子濃度達到108效果最佳[21，22]。
　　2  稻曲病菌的侵染方式
　　目前對稻曲病菌的侵染方式有兩種主要觀點。因為稻曲穗部發病是惟一可見病征，并且人工接種時穗部注射接種的方式發病率明顯高于根部接種，所以主流觀點傾向于認為稻曲病菌子囊孢子和厚垣孢子由上部隨水流進入孕穗期水稻穎殼內部完成侵染。Ashizawa等[23]使用GFP熒光菌株對侵染位點進行觀察，提出病原菌是從潁殼頂端外稃和內稃之間的縫隙進入。Tang等[24]認為菌絲進入潁殼內后首先侵染上部的花絲、花藥和柱頭，然后菌絲將雄蕊和雌蕊完全覆蓋直至潁殼內充滿了菌絲。Song等[25]使用激光共聚焦對綠色熒光標記菌株在潁殼內擴展各個時期做了觀察并進行了詳細的描述。
　　稻曲病菌菌源空氣傳播的可能性較大。伏榮桃等[26]對不同氣象條件下稻曲病菌孢子釋放量進行了監測。發現高溫高濕的氣候條件利于孢子釋放，夏季天氣炎熱陰雨較多年份發病率也相應更高，推測空氣中懸浮的孢子量與發病率直接相關。俞咪娜等[27]對來自同一穗不同稻曲球，同一個稻曲球的不同部位分別進行了分離，意外的是來自同一個稻曲球的菌株致病力也存在分化現象。經過REP-PCR分子指紋圖譜（Repetitive DNA PCR-based genomic fingerprinting）遺傳多樣性分析，發現它們被劃分為不同的群體，由此推測一個稻曲球也可能混合不同來源菌株，穗部有可能同時接觸不同的初侵染菌株。以上結果說明稻曲病通過空氣傳播，側面說明穗部局部侵染的可能性較大。
　　另外一種觀點認為稻曲病菌由水稻根部侵入，自下而上完成系統性侵染。張舒等[28]發現田間水稻套袋以后仍然可以發病，并且室內試驗中只在種子和幼苗根部接種的植株后期均可以發病。劉見平等[29]研究發現土壤和種子消毒的處理發病率顯著降低，說明種子帶菌和土壤中越冬的病菌為主要初侵染源。陳永堅等[30]研究也發現帶有厚垣孢子的種子當年發病率更高。呂博等[31]使用厚垣孢子分別在水稻芽期和三葉期進行接種，此后水稻各個時期莖葉和穗部使用特異PCR檢測均有陽性。鄭大偉等[32]使用激光共聚焦顯微鏡對苗期侵染進行觀察，稻曲病菌能夠在細胞間隙內擴展。以上結果表明幼苗根部系統侵染存在可能，但目前無論是穗部局部侵染還是從根部系統性侵染都沒確鑿的證據，是單一侵染還是兩種侵染方式并存仍有待明確。
　　3  稻曲病菌的侵染機制
　　稻曲病是局部侵染還是系統侵染仍然沒有確鑿的證據，但水稻穗部穎花是主要侵染位點已經明確，所以穎花內的侵染模式也是稻曲病研究的重點。早期學者曾認為稻曲病菌只侵染已經受精的穎殼[33];后續的研究發現，雖然激活了灌漿相關基因的表達，但是被侵染的潁殼不能完成灌漿并形成子粒，而且子房受精的穎花內也無法形成稻曲球[34]。Tang等[35]將稻曲球解剖后顯微觀察發現其內部包裹的子房還是鮮活的。Song等[25]對花柱透射電鏡照片，發現菌絲侵入到花柱表皮細胞和柱頭細胞的縫隙當中，并且擴展到細胞間質，但沒有穿透寄主細胞?；ǚ鄣某墒焓艿搅艘种疲M了子房受精，病菌挾持了灌漿基因，為菌絲的生長提供營養。
　　稻曲病菌是比較典型的活體營養型病原菌，但與稻瘟病等其他菌株不同，沒有明顯的壞死斑出現，為了探究它如何克服寄主免疫防衛反應，Yin等[36]分析了bZIP轉錄因子家族基因，數據表明28個基因中有17個在侵染階段表達上調，說明基因表達動態變化劇烈。對早期侵染階段的轉錄組分析也發現分泌蛋白、次級代謝以及病原寄主互作相關基因高度富集[37]。Fang等[38]利用煙草瞬時表達系統對119個假定效應蛋白進行篩選，其中有13個能夠引起壞死斑。通過酵母驗證了其中11個具有分泌活性，并利用水稻原生質體確定了其致死活性。Zhang等[37]也對基因組中具有分泌活性的假定效應蛋白進行了分析，并且利用煙草瞬時表達系統鑒定了18個能夠抑制壞死的效應因子。能夠抑制壞死的效應因子在稻曲病侵染過程中的作用無疑是非常重要的。但是相比稻瘟病、小麥白粉病和大豆疫霉在病原植物互作方面深入系統的研究，稻曲病菌目前還沒有病原植物直接互作的分子證據，也沒有找到與效應蛋白互作的抗性蛋白和代謝通路。 　　除對效應蛋白探索分析外，功能基因組研究是挖掘致病關鍵基因的高效方法。目前稻曲病菌基因組分析已經取得初步進展。Zhang等[37]使用Illumina和454平臺對UV-8b菌株進行了深度測序并成功拼接，基因組大小為39.4 Mb;預測得到8 426個基因;與來自10個子囊真菌和一個擔子菌基因組中的保守基因系統發育，分析發現稻曲病菌與兩個昆蟲病原真菌綠僵菌（Metarhizium spp）距離更近，甚至比侵染模式相似的麥角菌（Claviceps purpurea）更具親緣性[17]。在此基礎上稻曲病菌功能基因組的研究正在展開。Zheng等[39]首次報道對UvHog1基因成功敲除，發現敲除轉化子表現出菌絲、分生孢子的生長缺陷，并且對SDS、剛果紅和高滲環境敏感。Lv等[40]通過T-DNA插入體庫的方法篩選到與菌絲生長、分生孢子形成、非生物脅迫以及致病相關蛋白UvPro1并且通過敲除對其進行了驗證。Liang等[41]首次報道在稻曲病菌中使用CRISPR-Cas9系統對基因進行敲除，效率比傳統敲除體系高200倍。
　　4  問題與展望
　　由于氣候變化和栽培方式的改變，稻曲病流行情況日趨嚴重[42]。目前人類對稻曲病的了解仍然有限，以下方面仍然需要加強研究。
　　1）確定稻曲病初侵染來源及其侵染位點。利用攜帶分子標記的菌株接種對根部或苗期侵染發展動態進行監測。如何避免侵染過程中分子標記丟失，并且排除植物表面粘附孢子帶來的干擾是技術難點。
　　2）稻曲病菌活體營養機制尚需探究。從技術角度來說，在稻瘟病、白粉病和大豆疫霉中，效應蛋白與寄主互作的研究方法已經非常成熟;然而稻曲病菌與寄主互作模式可能存在獨特性，并且對水稻花器官組織侵染位點染色顯微觀察也存在困難。
　　3）目前通過圖位克隆的方法仍然沒有發現稻曲病的主效抗病基因，推測其抗病主要來源于數量性狀位點，而水稻穗部物理性狀差異對稻曲病致病力的影響也有待研究。
　　4）由于稻曲病侵染隱蔽、發病時段在水稻生產后期，所以對病害發生的預測預報技術開發非常急迫。在侵染前期使用LAMP等快速檢測方法評估菌源數量，采取對應的控制手段可以有效減少稻米生產損失。
　　5）稻曲球表面菌素會危害人畜健康安全，其上的厚垣孢子和子囊孢子都可以成為次年的初侵染源。但迄今為止，關于稻曲球形成機制相關研究較少，稻曲球發育相關基因及代謝通路的研究未來能夠幫助人類找到減少其形成的方法。
　　總的來說，稻曲病在水稻生長中的危害日趨嚴重，然而其侵染方式和侵染機制仍不明確，水稻抗病基因發掘和抗性品種的開發仍在進行。加強對稻曲病侵染規律和致病機理的研究，有利于在生產中對稻曲病進行全面防控。
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　　收稿日期：2018-12-26
　　基金項目：國家重點研發計劃項目（2016YFD0200807）;湖北省技術創新專項重大項目（2017ABA146）;湖北省農業科技創新中心項目（2016-620-000-001-017）
　　作者簡介：王佐乾（1988-），男，山東青島人，助理研究員，博士，主要從事水稻病害研究，（電話）18971622069（電子信箱）wangzuoqian@sina.com;通信作者，張  舒，研究員，（電子信箱）ricezs6410@163.com。
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