大白菜黑腐病研究進展

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　　摘    要：近年來，大白菜黑腐病日益加重。筆者綜述了大白菜黑腐病的病害癥狀、黑腐病病原菌的特征特性、黑腐病病原菌對抗氧化系統的影響、黑腐病蛋白質組學研究等進展。如黑腐病菌侵染植物后活性氧的生成速率增加、抗氧化酶活性也發生改變;蛋白質組學研究表明，防御和脅迫、及光合系統相關的蛋白豐度增加，茉莉酸和乙烯途徑被激活。
　　關鍵詞： 大白菜; 黑腐病; 特征特性; 抗病性鑒定
　　Research progress on black rot in Chinese cabbage
　　MENG Xuejiao1，2， SHI Qingxin2， CHEN Lixin 2
　?。?. Postdoctoral Programme， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150086， Heilongjiang， China; 2. Horticultural Sub-academy， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150069， Heilongjiang， China）
　　Abstract： In recent years， black rot in Chinese cabbage has become increasingly serious. This paper reviews the research progress of black rot disease symptoms in Chinese cabbage， the characteristics of its pathogen， the effects of its pathogen on the antioxidant system， proteomics study of this disease， etc.. Such as infection of its pathogen lead to increase of the rate of reactive oxygen species production， and changes of the activity of antioxidant enzymes. Proteomics studies show that the abundance of defense and stress， and photosynthetic system-related proteins increased， jasmonic acid and ethylene pathways are activated.
　　Key words： Chinese cabbage; Black rot; Characteristics; Identification of disease resistance
　　全國白菜種植面積從1996年的60萬hm2擴大到2014年的260萬hm2，占全國蔬菜總面積的13%;總產量11 000萬t，占全國蔬菜總產量的15.5%。十字花科蔬菜黑腐病是由野油菜黃單胞菌野油菜致病變種[Xanthomonas campestris pv. campestris （Pam.） Dowson]引起的世界性重要病害之一[1]。黑腐病寄主范圍相當廣泛，主要危害甘藍、結球白菜、不結球白菜、蘿卜、油菜、花椰菜、青花菜、綠菜花等[2-12]。由于氣候條件變化、多茬栽培、國外春大白菜品種的引進和黑腐病病原菌分化等，黑腐病對蔬菜生產的威脅日益加重。20世紀80年代，黑腐病在全國各地已經普遍流行，北起黑龍江、南至海南島均有分布，使大白菜產量和品質遭受很大損失[13-15]，并且感染了十字花科以外的蔬菜[16]。
　　1 大白菜黑腐病病害癥狀
　　十字花科蔬菜黑腐病主要發生在秋季，早播、多雨時節和重茬地塊發病嚴重[17]。十字花科黑腐病菌通過排水器、氣孔、根、或創傷口侵染十字花科植物，主要危害葉片、葉球和球莖[18-19]。大白菜幼苗期即可發病，但以成株發病為主。
　　大白菜幼苗期發生黑腐病時，真葉的葉脈上出現小黑斑或細黑條，根髓部變黑;成株期時，細菌從葉緣的水孔侵入，之后形成三角形褪綠黃斑，葉緣產生黃褐色壞死斑，再沿葉脈蔓延，逐漸擴大成“V”字形或長條形黃褐斑，邊周伴有黃色褪綠暈帶，該葉脈變黑壞死[20]。
　　2 黑腐病菌特征特性研究
　　野油菜黃單胞菌野油菜致病變種（Xanthomonas campestris pv. Campestri）（Xcc）為短桿菌，革蘭氏染色陰性，細胞大小為（0.4～0.5） μm×（0.7～3.0） μm，有莢膜，無芽孢，極生鞭毛，菌體單生或鏈生。在牛肉膏瓊脂培養基上近圓形，初期呈淡黃色，后期變蠟黃色，形成黏稠狀菌落。黑腐病菌生長最適溫度為25～30 ℃，最低5 ℃，最高39 ℃，致死溫度為51 ℃，最適濕度為80%～100%[21]，在干燥環境下仍可存活12個月[22]。
　　研究發現黑腐病病原菌的生理小種分化十分復雜。有關1、4、6號生理小種的報道是最多的。解永梅等[23]分別在細胞和分子水平上完成了山東省地區的黑腐病病原菌鑒定，進行致病性測定后獲得4株強致病力的菌株，結果發現，這些病原菌的生物學特性基本一致，可以確定為同一種病原菌，并鑒定為Xanthomonas campestris pv.campestris，并確定此病原菌就是引起山東省大白菜黑腐病的致病菌。蘆燕等[24]對采自陜西省不同地區的35個大白菜黑腐病病原菌菌株的致病類型進行了劃分，用7個不同抗性大白菜品種作為鑒別寄主，根據植物的抗病性反應將這35個大白菜黑腐病菌株劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 6類致病型，其中，Ⅲ型致病力最強，Ⅱ型為典型致病型。 　　其他研究，如侵染擬南芥的3個菌株CN14，CN15和CN16的基因組序列被檢測，獲得了不可預期的結果，在日后分析比較方面具有重要作用[25]。
　　3 抗病性鑒定
　　近年來，我國對大白菜黑腐病的研究報道不多。在抗病育種過程中，進行抗病性鑒定來篩選抗病品種是必不可少的。因溫度、濕度等試驗條件相對較易控制，且節約空間，所以，抗病性鑒定工作主要在室內進行。
　　翟文慧等[26]進行了大白菜黑腐病鑒定的濕度試驗，及其苗期與成株期抗病性的相關分析研究，研究發現大白菜苗期與成株期抗病性呈顯著線性關系，說明用苗期人工接種鑒定大白菜黑腐病抗性的方法可行且可靠，可以縮短研究時間。
　　蘆燕和張魯剛[27]以陜西省大白菜主產區致病力強的黑腐病菌株YL-17做菌源，以4個不同抗病性的大白菜品種為試材，研究了苗齡、接種濃度和發病溫度對抗病性鑒定的影響，建立了優化的大白菜黑腐病苗期人工接種鑒定方法，該方法鑒定結果準確可靠。即接種方法采用噴霧法，接種菌量為1.0×108 pfu·mL-1，接種時期為4～5葉期，發病溫度控制在26 ℃。解永梅[20，23]對山東省大白菜黑腐病的研究，完善了黑腐病抗病性鑒定方法研究，證明了黑腐病菌存在致病型分化，并進行了抗性資源的篩選等。
　　4 黑腐病菌對抗氧化系統和植物細胞結構的影響
　　植物感染病原菌后，體內活性氧生成速率、防御酶的活性發生改變，并發現這些變化與植物的抗病性相關。
　　解永梅等[20]對不同抗性白菜品種接種黑腐病菌，接種后發現，抗病品種多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性高于感病品種，且PPO活性的變化與品種抗病性表現呈正相關。多酚氧化酶（PPO）可催化酚類物質氧化成醌，具有很強的毒性，能殺死病原菌，推測抗病品種抗黑腐病可能與PPO活性升高有關。苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）是植物次生物質代謝系統中關鍵的一個酶，解永梅等[20]的研究還發現PAL與PPO的表現相同，即抗性強的品種中 PAL的活性要高于抗性弱的品種，激活次生代謝。
　　蔚麗珍等[28-29]對黑腐病菌侵染不同抗性大白菜幼苗后葉片抗氧化系統的反應也進行了研究，發現在接種黑腐病菌36 h后超氧陰離子產生速率直線上升，且抗性品種的增加更為明顯，丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）作為膜脂過氧化的標志，其含量均上升，但總體上來說抗病品種的MDA含量明顯低于感病品種，表明 MDA含量與抗病性呈負相關。總體上，抗病品種和感病品種接種黑腐病菌后超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性均高于對照，這與解永梅[20]之前的研究結果一致，阻止了體內活性氧的過量積累，SOD活性與抗病性呈正相關。過氧化物酶（peroxidase，POD）活性升高，與解永梅[20]的研究結果一致，且發現與不同的發病階段相一致，與抗病性呈負相關。過氧化氫酶（catalase，CAT）活性則二者變化不一致，抗性材料表現為升-降-升，感性材料表現為先降后升。而解永梅[20]的研究發現接種黑腐病菌后，不同抗性品種的CAT活性均急劇下降，之后感病品種呈現持續下降的趨勢，而抗病強的品種在下降之后呈現上升趨勢達到最高峰后又逐漸下降。
　　其他十字花科蔬菜也有相關研究，如通過比較不同抗病類型的青花菜接種黑腐病菌后防御酶活性的變化，發現抗病材料具有較高的POD、PPO、PAL活性，而感病材料的SOD活性較高[30]。接種后抗病材料的SOD、POD、PAL、PPO和CAT活性均高于對照，且活性變化率高于感病材料[30]，與他人相關研究結果一致，“抗病”品種比“感病”品種保持了較高的酶活性[31];甘藍黑腐病的研究發現，接種病原菌后，6個品種葉片中SOD、POD、PAL和PPO等4種酶活性均升高，且品種間差別較大[32]。
　　不同抗性材料接種黑腐病菌后發現，抗病材料細胞內膜結構和細胞器受損傷程度較輕且較晚，并伴隨細胞壁加厚和膜結構小泡數量增多的現象，且細胞壁周圍有致密聚集物出現;而感病材料受損嚴重且較早，細胞出現嚴重的質壁分離現象，細胞器膨脹變形，功能喪失，最后整個細胞解體死亡[30，33]。
　　5 轉錄組與蛋白質組學研究
　　黑腐病菌轉錄組的研究發現，prc基因，即XCC致病機制相關的特殊蛋白酶發生轉位子突變，引起毒性及胞外蛋白質產量降低，RNA-Seq發現91個差異表達基因，這些基因主要參與碳水化合物轉運和代謝、細胞壁/細胞膜生成、翻譯后修飾、蛋白周轉和分子伴侶、無機離子轉運和代謝、及信號轉導機制[34]。
　　蛋白質組學技術的不斷發展和完善，為深入分析植物應答生物及非生物脅迫的代謝和調控機制提供了高通量的技術平臺，利用此平臺中的雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）技術、凝膠染色技術、同位素標記相對和絕對定量技術（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）、以及生物質譜技術等能夠系統地分析植物體細胞、亞細胞結構、組織和器官應答脅迫的蛋白質組變化。
　　關于野油菜黃單胞菌野油菜致病變種與寄主甘藍（Brassica oleracea）表達的最新蛋白質組學研究，即Santos等[35]運用label-free shotgun 2D-nanoUPLC/MSE分析XCC與易感植物（Kenzan-REK）、抗性植物（Uni?ao-REU）共生及培養基（對照）中情況，并運用qPCR方法確定被選擇的一些基因的差異表達情況，該篇文章主要研究病菌的致病性機制。一些野油菜黃單胞菌株的完整基因組序列已知，可以編碼4 000多個蛋白質。發現在病原菌侵染48 h后Xcc 細胞數量最多，之前該研究團隊也運用雙向電泳技術研究XCC與甘藍互作，但是只鑒定了少量蛋白。大部分報道都是研究細菌在培養基中培養，很少研究黃胞桿菌屬蛋白積累在植物提取物中。通過比較抗性植物（REU）及對照，發現121個差異蛋白質，鑒定到108個差異蛋白質，其中80個是對照特有的，在抗性植物中14個蛋白質上調，14個蛋白質下調。易感植物與對照的比較中，發現127個差異蛋白質，鑒定到105個差異蛋白質，其中46個是對照特有的，在易感植物中34個蛋白質上調，22個蛋白質下調，大部分差異蛋白表達豐度是增加的，主要參與細胞代謝（如檸檬酸循環、糖酵解、氧化磷酸化、磷酸戊糖途徑、及其他碳水化合物代謝），15%參與蛋白質合成（如轉錄和翻譯因子，及核糖體蛋白）?？剐灾参锱c易感植物進行比較，發現17個差異表達蛋白，易感植物中有4個蛋白質上調，13個蛋白質下調，且有5個蛋白是易感植物特有的。在植物中，鑒定到參與乙烯感應和誘導茉莉酸的蛋白質，說明甘藍與病原體互作過程中茉莉酸和乙烯途徑被激活。特別的是，一些防御和脅迫相關蛋白在抗性植物中被鑒定到，如脂氧合酶、膜聯蛋白等，還有光合系統相關的蛋白，這些都說明植物通過增加調節光合作用的重要蛋白質來減少黑腐病菌帶來的損傷[35]。 　　6 展 望
　　大白菜因其纖維素含量豐富，受廣大消費者的喜愛，種植面積較大，尤其是東北地區，因受傳統習俗影響，人們還有貯藏秋菜和腌制酸菜的習慣。另一方面，近年來，隨著白菜加工業不斷壯大，對白菜的需求量一直較大。田間調查發現，黑龍江省大白菜的黑腐病日益加重，為了保證市民的菜籃子工程，急需加大力度對其進行研究，通過分子生物學、蛋白質組學等技術加強黑腐病菌致病機制的研究，急需培育滿足產業及市場需求的新一代優質多抗新品種。這不僅是科研工作者的任務，也是社會的需求。
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