蛹蟲草蟲草素研究進展

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　　摘 要：蟲草素是蛹蟲草中重要的生物活性之一，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、提高免疫力等生物功效，目前主要從蛹蟲草相關培養物中提取蟲草素。從蟲草素的藥理作用、提取、分離純化、測定以及優化蟲草素的產量方面進行綜述，總結蛹蟲草蟲草素研究進展，并進行相關展望。
　　關鍵詞：蛹蟲草;蟲草素;藥理作用;提取純化;產量
　　DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.02.019
　　Abstract： Cordycepin is one of the important biological activities in cordyceps militaris， with the biological effects of antitumor， antiinflammation， antibacterial， antivirus and improving immunity. At present， cordycepin is mainly extracted from cordyceps militarisrelated cultures. In this paper， the pharmacological effects， extraction， separation， purification， determination and optimization of cordycepin production were reviewed. The research progress of cordycepin was summarized and the related prospects were prospected.
　　Key words： Cordyceps militaris; Cordycepin; Pharmacological effect; Extraction and purification; Yield
　　蟲草素Cordycepin又稱冬蟲夏草素、蟲草菌素、蛹蟲草菌素，是一種腺苷類物質。別稱3′脫氧腺苷（3′deoxyadenosine），分子量為251 D，分子式組成為C10H13N5O3 ，紫外光的最大吸收波長為259 nm[1-2]。蟲草素最早是在蛹蟲草的培養濾液中發現并定名[3]。蟲草素既可以溶于水也可以溶于甲醇和熱乙醇，但不溶于苯、乙醚、氯仿[4]。蟲草素作為研究對象一直以來受到國內外學者的極高關注。本文對蟲草素的相關研究進展進行綜述。
　　1 蟲草素的藥理作用
　　1.1 抗腫瘤作用
　　蟲草素作為蟲草的主要生物活性之一，大量的試驗研究證實，蟲草素具有抗腫瘤作用，其對人的白血病細胞、肝癌細胞、人鼻咽癌KB細胞、宮頸癌HeLa細胞、肉瘤S180、Lewis肺癌、鼠的B16BL6黑素瘤細胞等均能產生明顯的抑制作用[5-11]。因此，蟲草素可作為抗腫瘤藥物的一種開發方向，且蟲草具有較高的天然安全性。
　　1.2 免疫調節作用
　　近些年有很多試驗研究證實，蟲草素具有免疫調節功能。有研究指出，蟲草素能顯著提高人外周血單核細胞IL10的分泌，同時會抑制IL2的分泌，表明其具有免疫調節作用[12]。此外也有報道蟲草素可以促進T淋巴細胞轉化[13]。
　　1.3 抗菌、抗病毒作用
　　蟲草素作為核苷類物質，對細菌、真菌、病毒等微生物的代謝有多重作用。有人研究了蟲草素對侵入型念珠菌具有抗真菌活性[14]。此外有大量的報道表明，蟲草素對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、炭疽桿菌等[15-16]均有抑制作用;對白血病病毒宿主細胞轉化有抑制作用;對人類皰疹病毒、腦膜炎病毒、HIV1型病毒等亦有殺傷抑制作用[17-18]。蟲草素作為一種廣譜抗生素引起國內外研究者的高度重視。
　　1.4 其他作用
　　有部分研究指出，蟲草素具有抗炎癥作用。有研究表明，蟲草素從某些方面可以干擾炎癥發生機制，從而抑制炎癥反應[19-20]。另外，蟲草素還具有溶血栓[21]的功效，調節血管壁[22]、抑制血小板凝集[23];蟲草素對布魯錐蟲有治療效果[24]。
　　2 蟲草素提取方法
　　當前蟲草素獲取的途徑主要有2種：一種是生物合成途徑，是由蛹蟲草相關培養中提取，包括子實體、菌絲體及發酵液;二是人工化學方法合成。對于蟲草素人工化學合成技術，國內外早有相關研究報道，但合成過程復雜，可重復操作性困難，原料、設備投入成本高、產率低[25]，且在合成過程中用到的大量有機溶劑會對環境造成不良影響，工業化生產難以實現。
　　蟲草素提取方法主要有浸提法、滲漉法、超聲法、索氏提取法、回流法及超臨界萃取等。凌建亞等[26]比較其中4種方法對蟲草素提取的影響。結果表明：浸提法耗時長且提取效果一般，不利于下一步試驗進行。而分別調整回流提取、索氏提取及超聲法提取的作用時間均得到相近結果。但采取超聲法提取更快捷、簡便，受外界干擾小，同時可減少回流前后稱重、補足溶劑定容所帶來的誤差。
　　陳偉等[27]分別利用水、乙醇、甲醇作為提取劑提取蛹蟲草子實體干粉中的蟲草素，對比發現蒸餾水是最佳溶劑。常見的把超聲、微波、酶法等作為輔助提取手段。張嘉等[28]利用水熱回流法、醇熱回流法、超聲水提法、超聲波醇提法進行試驗，研究表明超聲波醇提法提取率最高，確定的最佳提取工藝為75%乙醇超聲波提取3次、每次40 min、料液比1∶20。夏敏等[29]利用微波法提取蟲草素并用HPLC法測定其含量，微波法提取的最佳工藝為提取液10 mL、料液比1∶200、中火處理3 min，樣品中蟲草素測量值達12.16 mg·g-1，且比超聲波法提取率高。殷東林等[30]以蛹蟲草子實體干粉為材料，提取劑為70%乙醇，然后通過正交試驗進一步研究，最終確定的最佳工藝為微波功率350 W、處理4 min、提取2次、料液比1∶50，提取率高達6.87%。張鳳清等[31]選用北冬蟲夏草子座為材料進行蟲草素提取，結果顯示超高壓萃取效果最佳，其工藝為壓力500 MPa、容積體積分數50%、料液比1∶75、提取時間2 min，提取率達到5.5 　　mg·g-1。
　　3 蟲草素分離純化
　　自Cunningham[3]在1951年用活性炭和交換樹脂首次分離出蟲草素以來，各種分離方法不斷涌現，各有利弊，不斷發展。目前常用的蟲草素分離純化方法有多種，其中比較高效的方法有超臨界萃取法、離子交換樹脂吸附法、大孔吸附樹脂法。
　　離子交換樹脂吸附法關鍵在于選擇合適的離子交換樹脂。車振明等[32]用732NH4+型陽離子交換樹脂提取，但提取的蟲草素得率較低，只有81%。毛寧等[33]采用JK006陽離子與717陰離子交換樹脂相配合，得到純度達96.4%的蟲草素。
　　大孔樹脂的選擇要與目的成分極性相似[34]。曾昱等[35]利用大孔吸附樹脂法，填料XAD16樹脂，得到的蟲草素純度達到98%以上。劉艷芳等[36]采用NKAII型大孔樹脂分離蟲草素，反復結晶得純度達98%以上。李學軍等[37]采用ML7大孔樹脂純化蟲草素純度可達到92%以上。
　　此外，超臨界萃取技術發展迅速，陳順志等[38]利用超臨界萃取技術以蛹蟲草人工培養后的發酵物為原料，獲得的蟲草素晶體純度為50.0%～99.9%，該技術無污染，易操作，但成本高，不利于工業化生產。
　　蟲草素分離純化方法有多種，每種方法各有利弊，可多種方法聯用。徐文豪等[39]采用離子交換樹脂、大孔吸附樹脂處理和多次硅膠柱層析、薄層分離法得到核苷類物質，蟲草素是核苷類物質的一種，因此也可用于蟲草素分離[40]。
　　4 蟲草素測定
　　蟲草素作為一種生物活性物質，測定含量的方法有多種。目前主要的測定方法有高效液相色譜法（HPLC）、高效毛細管電泳法（HPCE）、薄層色譜法（TLCS）、TLCSHPLC聯用法。其中最常用的是高效液相色譜法（HPLC），精密度與準確度高，一般采用反相色譜法，以十八烷基鍵合硅膠為固定相，流動相有多種，采用C18填料的色譜柱，填料粒為5 mm，柱子直徑4.6 mm，柱子長為150 mm和250 mm，流動相為甲醇、水或甲醇、磷酸緩沖液，檢測波長為254、259和260 nm，檢測溫度為20～40℃，柱流速為0.5～1.0 mL·min-1，進樣量5～20 L[41]。
　　5  蟲草素產量提升優化
　　5.1 高產菌種的選育
　　提高蟲草素含量非常重要的措施之一就是獲得穩定遺傳的高產菌株。據現有的研究報道，蛹蟲草菌種選育的方法主要有化學試劑誘變、輻射誘變等。
　　Das等[42]采用高能離子束誘變蛹蟲草，獲得比對照組高72%的突變株。劉金彬等[43]利用離子束、亞硝基胍及離子束亞硝基胍誘變法處理蛹蟲草Cordyceps militaris JN168，獲得幾株較高產菌株，每組誘變都能提高蟲草素產量，最后獲得的復合誘變菌2，經過優化液體發酵，產量提高了5倍，高達1045.65 mg·L-1。曹照平等[44]用蛹蟲草FFCC5111 為出發菌株，通過 200 W 、22 kHz超聲強度聯合1% DES 復合誘變獲得突變株，經發酵培養，突變株FFCC5111c 產生的蟲草素比親株提高44.5%，高達4.142 g·L-1。此外，溫魯等[45]研究航天搭載蛹蟲草進行誘變，蟲草素產量比原始株提高了2.5倍。
　　5.2 優化培養條件
　　當前蟲草素的生物合成途徑主要有2種：一種是固體培養的子實體中提取，但蟲草素含量一般只有0.5%左右或者更低[46]，因此難以滿足市場需求。二是菌絲發酵液中提取，97%～98%的蟲草素分泌在發酵液中，且液體發酵周期短，產量較子實體中高。
　　秦鵬等[47]利用響應面法優化蛹蟲草液體發酵條件，得出蟲草素積累量達到852.621 μg·mL-1，其優化培養條件：KNO3 0.04 g、酵母浸膏1.50 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、KH2PO4 0.2 g·mL-1、葡萄糖3.82 g、ZnSO4·7H2O 0.06 g、MgSO4·7H2O 0.13 g、維生素B1 0.08 g，（含量均是按100 mL計）;同等條件下，發酵8 d、靜置10 d后，蟲草素積累量高達936.225 μg·mL-1。湯佳鵬等[48]研究蛹蟲草表面液體發酵結果表明組合使用0.55 mg·L-1三十烷醇、22.64 mg·L-1 赤霉素與 1.69 mg·L-1  6芐基腺嘌呤的組合是最有利于蟲草素積累的組合，蟲草素最大產量達到 7.31 g·L-1。閆瑞等[49]研究在蛹蟲草FFCC5111液體發酵添加前體物，結果表明，添加腺苷、苯丙氨酸、腺嘌呤、甘氨酸和L谷氨酰胺均可提高蟲草素產量，其中添加腺苷1.5 g·L-1的發酵液中蟲草素產量最高，為772.5 mg·L-1，是對照組的9.39倍。據秦鵬、王龍等[50]的專利，利用腺嘌呤補料公式配比補料發酵液，其優化配方：葡萄糖35 g、蛋白胨17 g、腺嘌呤2 g、甘氨酸14 g、KH2PO4 1 g、MgSO4·7H2O 1 g、pH值自然，制得發酵濾液蟲草素產量達到 956.020 μg·mL-1，對照提高了535.66%。Masuda等[51]在基本培養基中加入1 g·L-1腺嘌呤和16 g·L-1氨基乙酸，使得蟲草素產量提高了4.1倍。陳長蘭等[52]分析了蛹蟲草液體搖瓶過程中分別添加20種含量0.2 g·100-1 mL的氨基酸，結果表明精氨酸、組氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸及丙氨酸的添加對蟲草素產量增加。周思靜等[53]研究在蛹蟲草液體培養基中加入金屬離子，結果表明添加Mn2+、Ca2+、Mg2+能夠顯著（P<0.05）提高蛹蟲草液體培養胞外蟲草素產量，最適濃度分別是0.05、0.6、1.0 g·L-1。阮元等[54]研究了添加不同濃度的維生素B1、B6和2，4D到常規培養基中，結果顯示中維生素B1和B6 的最佳添加濃度均為 0.83 g·L-1，2，4D 的最佳添加濃度為 0.015 mg·mL-1，此外還對比了滅菌前、后各添加維生素 B1，發現滅菌前的比滅菌后的蟲草素產量提高了19.9%。表明維生素B1的分解產物對蟲草素合成有促進作用。蔡水淋等[55]通過設計優化蛹蟲草液體深層發酵工藝，結果發現無機鹽FeSO4對蟲草素產量影響最顯著。 　　6 總結與展望
　　現代研究已表明，蟲草素具有多重藥理作用，包括抗菌、消炎、抗腫瘤、抗病毒、提升人體免疫力等功效，因此，在食品、醫藥、保健品等方面都有著巨大的開發價值和廣闊的市場前景。蟲草素自被發現有特殊的功效以來，引起國際上的專家學者的極大關注，對其研究也是多方面的，包括有提取制備、生物活性、藥用價值、作用機理以及開發應用等[25]。蟲草素提取制備主要研究高效的提取方法，以期更多的產量和更高的純度。蟲草素療效顯著，但大量分離獲得純品比較困難，導致市場蟲草素價格非常昂貴。蟲草素的合成途徑復雜，目前的研究報道絕大多數是利用生物合成途徑，主要以發酵菌絲的方式來獲取。但是以傳統的方法發酵菌絲蟲草素產量低下，不能滿足市場需求。因此，優化培養發酵條件，縮短周期，獲得更高產的產蟲草素的培養方式是將來發展的方向。市場上有著很多蟲草素開發的產品，只要是對人類健康有益的都會被接受，有重要的社會意義?？傊?，蟲草素的研究與開發已取得喜人的成就，隨著技術發展會有更廣闊的市場前景。
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