姜黃素對胰腺癌SW1990細胞耐吉西他濱的逆轉作用及機制研究

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　　摘 要 目的：研究姜黃素對胰腺癌SW1990細胞耐吉西他濱（GEM）的逆轉作用及機制。方法：采用CCK8法檢測不同濃度（50、100、150、200、250 μmol/L）GEM對SW1990細胞和耐GEM SW1990細胞（SW1990/GEM耐藥細胞）存活率的影響，計算半數抑制濃度（IC50）和耐藥倍數；采用CCK8法檢測不同濃度（1、5、10、20、40 μmol/L）姜黃素對SW1990/GEM耐藥細胞存活率的影響，計算IC50；采用CCK8法檢測2.41 μmol/L姜黃素與不同濃度（25、50、75、100、125 μmol/L）GEM聯用對SW1990細胞和SW1990/GEM耐藥細胞存活率的影響，計算GEM的IC50和耐藥逆轉倍數。采用流式細胞儀檢測以GEM的IC50為給藥濃度，GEM單用、姜黃素（2.41 μmol/L）與GEM聯用處理SW1990細胞和SW1990/GEM耐藥細胞后的細胞凋亡率和細胞周期分布，并采用Western blot法檢測細胞中脂肪酸合成酶（FAS）、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、磷脂酰肌醇激酶（PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）及其相關X蛋白（Bax）的蛋白表達，反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測mRNA表達。結果：GEM對SW1990細胞的IC50為92 μmol/L，對SW1990/GEM耐藥細胞的IC50為216 μmol/L，SW1990細胞對GEM的耐藥倍數為2.35；姜黃素對SW1990/GEM耐藥細胞的IC50為9.2 μmol/L；2.41 μmol/L姜黃素下，GEM對SW1990細胞的IC50為75 μmol/L，對SW1990/GEM耐藥細胞的IC50為98 μmol/L，SW1990/GEM耐藥細胞對GEM的耐藥逆轉倍數為2.2。與GEM單用比較，姜黃素與GEM聯用時SW1990細胞和SW1990/GEM耐藥細胞的凋亡率均明顯升高（P<0.05），主要阻滯在G0/G1期，細胞中FAS、p-AKT、p-PI3K、Bcl-2蛋白表達水平和FAS、Bcl-2 mRNA表達水平均明顯降低（P<0.05），Bax、Cascapse-3蛋白表達水平和mRNA表達水平均明顯升高（P<0.05）。結論：姜黃素可逆轉SW1990細胞對GEM的耐藥性，其機制可能與PI3K/AKT通路有關。
　　關鍵詞 姜黃素；吉西他濱；胰腺癌SW1990細胞；耐藥；凋亡；機制
　　Reversal Effects of Curcumin on Gemcitabine-resistant Pancreatic Cancer SW1990 Cells and Its Mechanism Study
　　PENG Mengyuan，QIU Feng，HUANG Dan，QIN Xia，ZHANG Yuan（Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of curcumin on gemcitabine （GEM）-resistant pancreatic cancer SW1990 cells and its mechanism. METHODS： CCK8 assay was used to detect the effects of different concentrations of GEM （50， 100， 150， 200， 250 μmol/L） on the survival rate of SW1990 cells and GEM-resistant SW1990 cells （SW1991/GEM resistant cells）； half inhibitory concentration （IC50） and drug resistance multiple were calculated. CCK8 assay was performed to detect the effects of different concentrations of curcumin （1， 5， 10， 20， 40 μmol/L） on survival rate of SW1990/GEM resistant cells， and IC50 was calculated. CCK8 assay was used to detect the effects of curcumin 2.41 μmol/L combined with different concentrations of GEM （25， 50， 75， 100， 125 μmol/L） on the survival rate of SW1990 cells and SW1990/GEM resistant cells， and IC50 and drug resistance reversal fold of GEM were calculated. Flow cytometry was carried out to detect the cell cycle distribution and apoptosis rate of SW1990 after treated with GEM alone or curcumin （2.41 μmol/L） combined with GEM using IC50 of GEM as drug concentration. Western blot assay was used to the protein expression of FAS， AKT， p-AKT， PI3K， p-PI3K， Caspase-3， Bcl-2 and related X protein （Bax）. RT-PCR was used to detect mRNA expression. RESULTS： IC50 of GEM to SW1990 cells was 92 μmol/L. IC50 of GEM to SW1990/GEM resistant cells was 216 μmol/L， and drug resistance multiple SW1990 cells to GEM was 2.35. IC50 of curcumin to SW1990/GEM resistant cells was 9.2 μmol/L. Under 2.41 μmol/L curcumin， IC50 of GEM to SW1990 cells was 75 μmol/L， and IC50 of GEM to SW1990/GEM resistant cells was 98 μmol/L； drug resistance reversal multiple of SW1990/GEM resistant cells to GEM was 2.2. Compared with GEM alone， the apoptosis rate of SW1990 cells and SW1990/GEM resistant cells were increased significantly after curcumin combined with GEM （P<0.05）， blocking at G0/G1 phase； the protein expression of FAS， p-AKT， p-PI3K and Bcl-2 and mRNA expression of FAS and Bcl-2 were decreased significantly （P<0.05）； the protein and mRNA expression of Bax and Caspase-3 were increased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Curcumin can reverse drug resistance of SW1990 cells to GEM， the mechanism of which may be associated with PI3K/AKT pathway. 　　KEYWORDS Curcumin； Gemcitabine； Pancreatic cancer SW1990 cell； Drug resistance； Apoptosis； Mechanism
　　胰腺癌是常見的惡性腫瘤之一，而吉西他濱（Gemcitabine，GEM）是目前臨床上常用的針對胰腺癌的化療藥物[1-2]。胰腺癌細胞對GEM耐藥可能是耐藥相關蛋白導致藥物攝取減少或藥物外排增加，或改變了細胞凋亡途徑的活性，而影響細胞凋亡途徑的主要機制是非典型耐藥相關蛋白導致的DNA損傷修復機制增強及磷脂酰肌醇激酶（PI3K）、磷酸化的蛋白激酶B（p-AKT）等信號調控轉導通路的活性改變等[3]。研究證實，異常的脂肪代謝與惡性腫瘤的發生發展有著密切的聯系[4-6]，包括胰腺癌在內的惡性腫瘤細胞生長代謝所需要的腺苷三磷酸（ATP）也來源于脂肪酸的代謝。脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase，FAS）是脂類物質合成過程中的限速酶，是脂質合成中的關鍵酶[7]，大量研究表明，FAS與多種腫瘤的發生發展密切相關，是代謝性致癌基因[8-9]。有研究表明，胰腺癌細胞中FAS表達異常或細胞中脂質代謝異常均與胰腺癌細胞對化療藥物產生耐藥性有關[10-11]。姜黃素作為一種天然存在的FAS抑制劑，能抑制多種癌細胞的增殖并促進其凋亡，在腫瘤的發生發展中起著重要作用[12-13]，但關于其是否也對胰腺癌耐藥細胞具有逆轉作用及其是否也是通過FAS發揮耐藥逆轉作用及作用機制的相關研究較少，本文就此進行了研究。
　　有研究表明，應用PI3K抑制劑LY294002與GEM共處理GEM耐藥的胰腺癌細胞，細胞明顯表現出凋亡，同時還發現GEM誘導凋亡的增加與p-AKT減少密切相關[14]。因此筆者推測，姜黃素可能通過影響PI3K/AKT通路及其下游相關因子逆轉胰腺癌細胞對GEM的耐藥性。綜上，在本研究中，筆者采用人胰腺癌細胞株SW1990和耐GEM SW1990細胞株（SW1990/GEM耐藥細胞），以流式細胞術觀察細胞凋亡情況及細胞周期的分布，初步分析姜黃素對SW1990細胞耐GEM的逆轉作用機制。
　　1 材料
　　1.1 儀器
　　HH-CP-01W CO2細胞培養箱（上海蘭儀實業有限公司）；Bio-Plex200流式細胞儀（美國Bio-Rad公司）；DA7600實時定量核酸擴增熒光（qPCR）檢測系統（美國Bio-Rad公司）；SpectraMax iD3多功能酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]。
　　1.2 藥品與試劑
　　姜黃素原料藥（美國Sigma公司，批號：SLBN7214V，純度：≥97%）；注射用鹽酸吉西他濱（江蘇豪森藥業股份有限公司，批號：160802，規格：1.0 g）；胎牛血清（上海聯碩生物科技有限公司，批號：11061-1125）；RPMI1640培養基（美國Corning公司，批號：05118006）；CCK8試劑盒、二氨基聯苯胺（DAB）辣根過氧化物酶顯色試劑盒和Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：C0037、P0202、C1062M）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒和Trizol試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司，批號：C503021-0500、B511311- 0100）；反轉錄（RT）試劑盒和qPCR試劑盒（北京全式金生物技術有限公司，批號：AE101、AQ101-01）；鼠抗人PI3K、AKT、B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）及其相關X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司，貨號：sc- 7480、sc-7272、sc-7382、sc-7412、sc-7469、sc-47724）；鼠抗人FAS單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：ZA-0005）。
　　1.3 細胞株
　　人胰腺癌細胞SW1990購自中科院細胞庫。
　　2 方法與結果
　　2.1 姜黃素溶液的制備
　　姜黃素臨用時以少量二甲基亞砜（DMSO）溶解姜黃素對照品，再加培養液稀釋至所需濃度（DMSO終體積分數<0.01%）。
　　2.2 細胞培養
　　將SW1990細胞用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養基在37℃的CO2細胞培養箱中培養，24 h換液，待細胞融合度達到80%～90%時，用0.25 g/L的胰酶消化液對細胞進行傳代培養，利用GEM濃度梯度遞增法建立人胰腺癌SW1990/GEM耐藥細胞，以3 μmol/L的GEM維持細胞耐藥性。SW1990細胞和SW1990/GEM耐藥細胞均采用RPMI1640培養基培養。
　　2.3 統計學方法
　　采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，所有數據均以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。
　　2.4 GEM對SW1990細胞和SW1990/GEM耐藥細胞的增殖抑制作用
　　消化SW1990細胞和SW1990/GEM耐藥細胞，制備單細胞懸液，接種于 96 孔板，每孔 3×103個；置于37 ℃的CO2培養箱繼續培養 24 h，取出培養板，棄培養液加入不同濃度（50、100、150、200、250 μmol/L）的GEM溶液（溶劑為生理鹽水），每個濃度3個復孔，同時設不加藥物的空白組。每孔終體積為200 μL；再置于培養箱培養48 h，棄培養液，每孔加入含CCK8試劑10 μL的培養液200 μL，染色2 h，使用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度（A），計算SW1990細胞和SW1990/GEM耐藥細胞的存活率，以GEM的不同濃度與細胞的存活率作圖，確定細胞的半數抑制濃度（IC50），再計算SW1990細胞對GEM的耐藥倍數。存活率=A給藥組/A空白組×100%，耐藥倍數=IC50（SW1990/GEM耐藥細胞）/IC50（SW1990細胞）。結果顯示，GEM對SW1990細胞的IC50（92 μmol/L）顯著低于對SW1990/GEM耐藥細胞的IC50（216 μmol/L），差異有統計學意義（P<0.05），表明GEM對SW1990細胞的增殖抑制作用顯著強于對SW1990/GEM耐藥細胞的增殖抑制作用，SW1990細胞對GEM的耐藥倍數為2.35。不同濃度GEM對SW1990細胞與SW1990/GEM耐藥細胞存活率的影響見圖1。 　　2.5 姜黃素對SW1990/GEM耐藥細胞的增殖抑制作用
　　消化SW1990/GEM耐藥細胞，制備單細胞懸液，接種于96孔板，每孔 3×103個；置于37 ℃的CO2培養箱繼續培養 24 h，取出培養板，棄培養液加入不同濃度的姜黃素（1、5、10、20、40 μmol/L），每個濃度3個復孔，同時設不加藥物的空白組。按“2.4”項下方法培養48 h，加入CCK8試劑染色后，檢測450 nm波長處的A，計算存活率，并以藥物的不同濃度與細胞的存活率作圖，確定細胞的IC50。結果顯示，姜黃素對SW1990/GEM耐藥細胞有增殖抑制作用，且呈濃度依賴性，IC50為9.2 μmol/L。為了避免細胞增殖抑制作用是由姜黃素引起的，后期選擇無顯著細胞毒性（細胞抑制率小于15%）的姜黃素濃度2.41 μmol/L作為聯用時的試驗濃度。不同濃度姜黃素對SW1990/GEM耐藥細胞存活率的影響見圖2。
　　2.6 姜黃素聯用GEM對SW1990細胞和SW1990/GEM耐藥細胞的增殖抑制作用
　　取SW1990細胞和SW1990/GEM耐藥細胞，分別用2.41 μmol/L的姜黃素聯合不同濃度的GEM（25、50、75、100、125 μmol/L）進行處理，培養48 h，加入CCK8試劑染色后，檢測450 nm波長處的A，計算存活率，確定聯用2.41 μmol/L姜黃素條件下GEM的IC50，再計算聯用2.41 μmol/L姜黃素條件下SW1990/GEM耐藥細胞對GEM的耐藥逆轉倍數，耐藥逆轉倍數=IC50（SW1990/GEM耐藥細胞+GEM）/IC50（SW1990/GEM耐藥細胞+姜黃素+GEM）。結果顯示，姜黃素與GEM聯合處理細胞后，GEM對SW1990細胞的IC50為75 μmol/L，低于GEM單用時的IC50（92 μmol/L）；對SW1990/GEM耐藥細胞的IC50為98 μmol/L，明顯低于GEM單用時的IC50（216 μmol/L）（P<0.05），聯用2.41 μmol/L姜黃素條件下SW1990/GEM耐藥細胞對GEM的耐藥逆轉倍數為2.2。姜黃素聯用不同濃度GEM對SW1990細胞和SW1990/GEM耐藥細胞存活率的影響見圖3。
　　2.7 姜黃素聯用GEM對SW1990細胞和SW1990/GEM耐藥細胞周期和凋亡的影響
　　取SW1990細胞分為SW1990+GEM組（SW1990細胞+92 μmol/L GEM）、SW1990聯用組（SW1990細胞+75 μmol/L GEM+2.41 μmol/L姜黃素處理）；取SW1990/GEM耐藥細胞分為SW1990/GEM+GEM組（SW1990/GEM耐藥細胞+216 μmol/L GEM）、SW1990/GEM聯用組（SW1990/GEM耐藥細胞+98 μmol/L GEM+2.41 μmol/L姜黃素），加入相應藥物培養48 h后，經胰酶消化，PBS沖洗3次，離心取沉淀，每組加入 1×Annexin Ⅴ結合緩沖液100 μL，充分混勻細胞后，加入 5 μL Annexin Ⅴ-FITC染液和5 μL 碘化丙啶（PI）染液，室溫避光孵育15 min，然后每管加300 μL 1×Annexin Ⅴ結合緩沖液，孵育1 h后，使用流式細胞儀分別檢測各組細胞的凋亡率和周期分布。結果顯示，與對應的GEM組比較，聯用組SW1990細胞和SW1990/GEM耐藥細胞的凋亡率均明顯升高（P<0.05），主要阻滯在G0/G1期。4組細胞凋亡的散點圖見圖4，凋亡率的測定結果圖5，周期分布的流式圖見圖6，周期分布的測定結果見圖7。
　　2.8 細胞中FAS、PI3K、AKT、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達的檢測
　　細胞分組與給藥同“2.7”項下，培養48 h后，消化收集細胞，加入細胞裂解液，于 4 ℃，12 000 r/min離心10 min，提取細胞總蛋白，取 25 μg 蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后，100 V 恒壓電泳2 h，分離蛋白，然后進行轉模，室溫下用5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入鼠抗人FAS（1 ∶ 500）、PI3K（1 ∶ 500）、AKT（1 ∶ 500）、Bcl-2（1 ∶ 500）、Bax（1 ∶ 500）、Caspase-3（1 ∶ 500）單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，并選擇相應的二抗（1 ∶ 2 000）室溫孵育2 h，再用TBST緩沖液洗膜3次，使用增強化學發光（ECL）液顯示免疫印跡條帶，試驗重復3次。以目標條帶與內參GAPDH的比值評價蛋白表達水平。結果顯示，與對應的GEM組比較，聯用組SW1990細胞和SW1990/GEM耐藥細胞中FAS、p-AKT、p-PI3K、Bcl-2蛋白表達水平明顯降低（P<0.05），Bax、Caspase-3蛋白表達明顯升高（P<0.05）。4組細胞中FAS、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達的電泳圖見圖8，測定結果見圖9。
　　2.9 RT-PCR法檢測FAS、PI3K、AKT、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達
　　細胞分組與給藥同“2.7”項下，培養48 h后，經胰酶消化，收集細胞，用Trizol裂解細胞后試劑盒提取細胞總RNA，利用反轉錄試劑盒合成cDNA，利用PCR擴增后測RNA表達水平。其中反轉錄的引物由上海生工生物科技技術有限公司合成，其中FAS的引物：上游5′ -CTCCAAGGGATTGGAATTGA-3′ ，下游5′ -TTGGTGTTGCTGGTGAGTGT-3′ ，片段長度296 bp；AKT的引物：上游5′ -CTCATTCCAGACCCACGAC-3′ ，下游5′ - ACAGCCCGAAGTCCGTTA-3′ ，片段長度242 bp；PI3K的引物：上游5′ -GCCCAGGCTTACTACAGAC-3′ ，下游5′ -AAGTAGGGAGGCATCTCG-3′ ，片段長度236 bp；Bcl-2的引物：上游5′ -TTCTTTGAGTTCGGTGGGG- TC-3′ ，下游：5′ -TGCATATTTGTTTGGGGCAGG-3′ ，片段長度304 bp；Bax的引物：上游5′ -TCCACCAAGAA- GCTGAGCGAG-3′ ，下游 5′ -GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′，片段長度257 bp ；Caspase-3的引物：上游5′ -TGGAATTGATGCGTGATGTT-3′ ，下游5′ -GTCGGCATACTGTTTCAGCA-3′ ，片段長度834 bp；內參β-actin的引物：5-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3′ ，下游5′ -GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′ ，片段長度268 bp。試驗重復3次。結果顯示，與對應的GEM組比較，聯用組SW1990細胞和SW1990/GEM耐藥細胞細胞中FAS、Bcl-2 mRNA表達水平明顯降低（P<0.05），Bax、Caspase-3 mRNA表達水平明顯升高（P<0.05）。4組細胞中FAS、AKT、PI3K、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達的測定結果見圖10。 　　3 討論
　　GEM是臨床治療胰腺癌的一線藥物，但在化療過程中，由于耐藥性的產生，嚴重影響了化療的效果。有研究表明，逆轉耐藥性可顯著提升臨床的治療效果[16]。另一方面，腫瘤細胞為了滿足自身增殖、生長的需要，需要不斷從臨近組織中獲取能量，必然要通過異常的脂質代謝來實現，而FAS是脂質代謝過程中的關鍵酶。在本試驗中，通過前期預試驗檢測到胰腺癌組織及癌旁組織中FAS的表達量，結果顯示FAS在癌組織中高表達，表明FAS的過表達可能與胰腺癌的發生發展有關。姜黃素是一種天然存在的FAS抑制劑，能通過抑制FAS的表達而抑制癌細胞增殖并促進癌細胞凋亡。本研究發現，姜黃素對SW1990/GEM耐藥細胞的生長有抑制作用；在姜黃素濃度為2.41 μmol/L時，對SW1990/GEM耐藥細胞無明顯抑制作用，但與GEM聯用后，其抑制率又顯著升高。接著采用流式細胞術檢測表明，姜黃素使更多SW1990細胞與SW1990/GEM耐藥細胞處在G0/G1期進而促進細胞的凋亡。通過以上結果，筆者發現姜黃素能增敏GEM化療胰腺癌SW1990/GEM耐藥細胞株的效果，兩種藥物聯合使用可以更有效地抑制腫瘤細胞生長，誘導其凋亡。
　　PI3K/AKT信號通路在腫瘤細胞增殖、存活、侵襲轉移和耐藥性等方面產生非常關鍵的效應，而通路中某些成分變化可導致其功能發生改變[17]。Bax、Bcl-2共屬于Bcl-2基因家族，Bcl-2是細胞凋亡抑制基因，通常情況下Bcl-2和Bax兩種蛋白表達相對穩定，而當Bax處于高表達狀態，Bax-Bax同源二聚體數量明顯增多，細胞對死亡信號的反應性增強，從而誘導凋亡開始[18]。有文獻報道姜黃素可以影響 PI3K/AKT通路的活化，下調凋亡抑制蛋白，從而促進細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖[19]。由此推測，姜黃素有可能通過改變PI3K/AKT信號通路的傳導而逆轉SW1990/GEM耐藥細胞的耐藥。通過Western blot法檢測該通路及其下游凋亡相關蛋白，研究結果顯示，在聯用組中，PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白的表達水平下降，Bax與凋亡關鍵蛋白Caspase-3表達水平均升高。該結果提示，姜黃素聯用 GEM能影響PI3K/AKT信號途徑及其下游因子，其逆轉SW1990/GEM耐藥細胞耐藥，可能是通過下調PI3K蛋白表達，減少AKT磷酸化水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平，同時激發Bax-Bax同源二聚體對死亡信號的響應，活化Caspase-3，最終誘導細胞凋亡而實現的。同時有研究表明，棕櫚酸能對脂肪酸合酶抑制劑造成的細胞能量不足進行補救[20]，從反面表明姜黃素作為FAS抑制劑可通過引起胰腺癌細胞能量不足，影響細胞存活及正常凋亡，增加了SW1990細胞對GEM的敏感性。總之，姜黃素可能通過影響PI3K/AKT通路逆轉SW1990細胞對GEM的耐藥性。這些結果可為臨床治療胰腺癌中患者出現化療耐藥性時提供新的解決思路。
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　?。ㄊ崭迦掌冢?019-01-15 修回日期：2019-03-20）
　　（編輯：鄒麗娟）
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