大黃素對TGF-β1誘導的NRK-49F細胞增殖的影響

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　　摘要 目的：研究大黃素對TGF-β1誘導的腎成纖維細胞株（NRK-49F）增殖以及降低FN（纖連蛋白），Col-I（I型膠原蛋白），Smad2/3蛋白及基因表達的機制。方法：采用CCK8法檢測不同濃度大黃素對NRK-49F細胞增殖情況的影響;終濃度為20、40、80 μmol/L的大黃素處理NRK-49F細胞30 min后，模型組和觀察組均以TGF-β1以5 ng/mL的終濃度刺激24 h，并收集細胞，蛋白質免疫印跡技術（Western blot）檢測FN，Col-I，Smad2/3蛋白表達水平，實時熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測FN，Col-I，Smad2/3 mRNA表達。結果：模型組FN，Col-I，Smad2/3蛋白和基因的表達明顯增加，大黃素含藥血清組能抑制NRK-49F細胞增殖，且抑制FN，Col-I，Smad2/3蛋白和的表達（P<0.05）。大黃素濃度越高，抑制作用越明顯，成一定的量效關系。結論：大黃素干預后，可改善腎纖維化程度，保護NRK-49F細胞模型損傷。
　　關鍵詞 大黃素;NRK-49F細胞;纖連蛋白（FN）;I型膠原蛋白（Col-I）;Smad2/3
　　Abstract Objective：To investigate the mechanism of emodin on the proliferation of TGF-β1 induced renal fibroblasts（NRK-49F）and the reduction of protein and gene expressions of FN（fibronectin），Col-I（typeⅠcollagen）and Smad2/3.Methods：The effects of different concentrations of emodin on the proliferation of NRK-49F cells were detected by CCK8 assay.NRK-49F cells were treated with emodin at a final concentrations of 20，40，80 μmol/L for 30 min.Both the model group and the treatment group were stimulated with TGF-β1 at a final concentration of 5 ng/mL for 24 h，and the cells were collected.The expression levels of FN，Col-I and Smad2/3 protein were detected by Western blot，and the expressions of FN，Col-I and Smad2/3 mRNA were detected by real-time PCR.Results：The expression of FN，Col-I，Smad2/3 protein and gene in the model group was significantly increased.The emodin-containing serum group inhibited the proliferation of NRK-49F cells and inhibited the expression of FN，Col-I，Smad2/3 protein（P<0.05）.The higher the concentration of emodin was，the more obvious the inhibition was.Emodin concentration and inhibition were dose-effect relationships.Conclusion：After emodin intervention，it can improve the degree of renal fibrosis and protect the NRK-49F cell model injury.
　　Key Words Emodin; Renal fibroblasts（NRK-49F）; Fibronectin（FN）; Col-I; Smad2/3
　　中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.007
　　腎纖維化是一切慢性腎臟疾?。–hronic Kidney Disease，CKD）進展至終末期腎衰竭的共同通路，機制非常復雜，已影響全球人類的健康，成為世界公共衛生關注的主要關注點之一。我國CKD發病率達11%，患患者數已達1.2億。腎纖維化可以發展成為慢性腎衰竭（Chronic Renal Failure，CRF），而最終結局是終末期腎臟病（End-stage Renal Disease，ESRD）[1-2]。腎纖維化以腎臟成纖維細胞活化、增殖，進一步轉化成為肌成纖維細胞，及細胞外基質（Extracellular Matrix，ECM）在腎間質過度積聚，最終導致腎功能喪失為特征[3]。中藥由于其多環節、多方位、多靶點的作用優點，在治療腎纖維化方面具有獨特的優勢。大黃素是中藥大黃的有效單體成分之一，它能抗菌消炎、抗腫瘤，不僅可抑制腎臟成纖維細胞的活化增殖和ECM的積聚，還能保護腎成纖維細胞，減輕TGF-β1誘導的腎纖維化[4-7]。轉化生長因子-β1（TGF-β1）被認為是致纖維化因子之一，在多組織器官纖維化中起重要作用[8]。近年來運用大黃素治療腎纖維化報道已屢見不鮮，并且都取得了良好的療效。本文采用TGF-β1刺激大鼠腎臟成纖維細胞（NRK-49F）模型，觀察大黃素對NRK-49F細胞增殖以及對FN，Col-I，Smad2/3蛋白及基因的影響，探討大黃素對腎臟纖維化的保護作用機制。 　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 細胞株 NRK-49F大鼠腎臟成纖維細胞株，購自上海中科院細胞中心。大黃素（含量>98%），溶解于二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）后制成混懸液。將NRK-49F細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在含有5%CO2及飽和濕度的37 ℃恒溫培養箱中連續培養。細胞隔天換液，每2～3 d傳代1次。待細胞生長培養至60%～70%，胰酶消化并傳代，取對數生長期細胞用于實驗。
　　1.1.2 試劑與儀器 大黃素（Sigma，E7881）;TGF-β1人重組蛋白（美國Peprotech公司）、DMEM培養基、雙抗（美國Hyclone公司）;0.25%胰酶（美國Thermo Scientific公司）;二甲基亞砜（DMSO，上海生工有限公司）;Fbs10099-141胎牛血清（美國Gibco公司）;BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、PMSF、山羊抗兔二抗（威奧生物技術有限公司）;PVDF膜（美國Millipore公司，0.45 μm）;兔抗小鼠FN IgG、Col-I IgG、Smad2/3 IgG（英國Abcam公司）。BioTek Synergy2酶標儀（美國Biotek公司）;5810R臺式離心機（德國Eppendorf公司）;Mill-Q Integral 3超純水儀（美國Millpore公司）;二氧化碳培養箱（美國Thermo公司）;OLYMPUS IX71倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）;ProteinSimple FluorChem M全自動成像分析系統（美國ProteinSimple公司）;trizol試劑（美國Invitrogen公司）;熒光定量PCR儀（羅氏LightCycler 480）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 大黃素存儲液 精確稱取大黃素50 mg，并用1 mL DMSO超聲破碎溶解，加入4 mL培養基稀釋，得到大黃素濃度37 mmol/L儲存，使用時稀釋。
　　1.2.2 CCK 8法檢測細胞增殖活性 復蘇NRK-49F細胞，以每孔100 μL，4×104個細胞/mL接種于96孔板中，放入5% CO2及37 ℃培養箱中培養。待細胞貼壁后，棄去上清液，向各孔加入100 μL的（20、40、80、160、320）μmol/L大黃素進行實驗，每組平行設置5個復孔，并設空白對照組。加入各濃度大黃素培養12、24 h后，滴加10 μL CCK 8，用酶標儀測定450 nm波長處的吸光度OD值，計算細胞抑制率=（1-A檢驗組/A空白組）×100%。
　　1.2.3 細胞培養及分組 細胞分為5組：空白對照組、模型組（TGF-β1 5 ng/mL）、大黃素組（20、40、80 μmol/L）。取對數生長期的NRK-49F細胞株，胰酶消化，并以2×106個/mL的密度接種于六孔板中，細胞生長至60%～70%時，用無血清的培養基培養細胞24 h，觀察組分別加入終濃度為20、40、80 μmol/L的大黃素30 min后，模型組和觀察組都加入終濃度為5 ng/mL的TGF-β1刺激24 h，使每組的總體積為2 mL，然后收集細胞做蛋白印跡和qPCR分析。
　　1.2.4 Western Blot檢測蛋白表達 藥物干預24 h后，棄去上清液，并用PBS漂洗3次，RIPA裂解液：PMSF=50∶1的比例，在冰上裂解細胞5 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min后收集細胞。超聲破碎細胞收取上清液，并通過BCA方法測定蛋白濃度并定量。每份樣品蛋白上樣量均為40 μg，蛋白marker 5 μL，電泳80 V 120 min后，濕轉250 mA轉膜2 h，蛋白被轉移到0.45 μm的PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別與FN（ab2413，1∶500），Col-I（ab34710，1∶5 000），Smad 2/3（ab63672，1∶1 000），GAPDH（weiao，1∶2 000）一抗在4 ℃搖床孵育過夜。第2天TBST漂洗3次，10 min/次，再加入二抗，室溫下孵育1 h，并用TBST漂洗3次，10 min/次后曝光。GAPDH作為內參，Image J軟件進行灰度值分析。
　　1.2.5 實時熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測基因表達 按照Trizol試劑使用方法，提取各組細胞的總RNA。酶標儀檢測RNA濃度及純度，確保A260 nm/A280 nm在1.8～2.0為合格，表明RNA未降解。將RNA逆轉錄cDNA，反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。采取20 μL體系，PCR擴增反應：95 ℃ 30 s預變性，95 ℃ 5 s變性，60 ℃ 34 s退火延伸，40個循環。引物由上海生工生物工程有限公司合成（引物序列見表1）。結果用2-△△Ct進行數據分析，△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因，△△Ct=△Ct大黃素組-△Ct空白對照組，各組mRNA的相對表達量=2-△△Ct，其中空白對照組的數值設為1。
　　1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析。所有數據均以均數±標準差（±s）表示，多組之間均數比較，滿足正態分布和方差齊性則采用單因素方差分析（One way ANOVA），如果進一步比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統計學意義。
　　2 結果
　　2.1 對NRK-49F細胞增殖的影響 與空白對照組比較，濃度為160、320 μmol/L的大黃素對NRK-49F
　　2.2 大黃素對TGF-β1誘導下NRK-49F細胞FN，Col-I，Smad 2/3蛋白表達的影響 與空白對照組比較，經TGF-β1刺激的模型組細胞增殖，FN，Col-I，Smad 2/3蛋白都較對照組高表達（P<0.01）。而與模型組比較，各濃度大黃素均可下調FN，Col-I，Smad 2/3蛋白表達，差異有統計學意義（P<0.01）。圖1和表3。 　　2.3 大黃素對TGF-β1誘導下NRK-49F細胞FN，Col-I，Smad 2，Smad 3 mRNA表達水平的影響 與空白對照組比較，TGF-β1刺激后的NRK-49F細胞分泌的FN，Col-I，Smad 2，Smad 3 mRNA表達均上調（P<0.01）;與模型組比較，各濃度大黃素給藥組均可明顯抑制FN，Col-I，Smad 2，Smad 3 mRNA的表達，且大黃素給藥濃度越大，相關基因表達量越低（P<0.05，P<0.01）。見表4。
　　3 討論
　　腎功能的惡化程度與腎間質纖維化程度密切相關。腎纖維化是一種多信號通路傳導、多細胞因子介導、多因素驅動的慢性腎病，包括腎間質纖維化、腎小球和腎小管硬化，最終都將發展成為慢性腎衰竭[9]。腎纖維化的典型病理特征是間質成纖維細胞增殖，系膜增厚，固有細胞數量減少和ECM過度沉積。腎小球毛細血管因此損傷，血流量減少，腎小球毛細血管硬化，微循環出現障礙，最終腎臟萎縮、表面凹凸不平及變硬，出現腎臟結構被破壞及功能喪失[10-12]。腎臟纖維化是由多種原因導致細胞外基質過度沉積而引起，超過了其自身的代償能力，造成腎臟不可逆的腎臟病變。
　　在中醫學中并無“腎纖維化”的病名，屬于“關格”“水腫”“腰痛”“淋證”等范疇。病因為正氣不足，又感受外邪。其發病機制主要表現在“虛、濕、瘀、毒”4方面，其中“虛”是腎纖維化的起始因素，“濕”和“瘀”是病理基礎，“毒”是加重腎纖維化的重要方面。近些年一些專家學者提出腎纖維化與腎絡微型癥積理論，微型癥積與氣虛、氣滯、血瘀等密切相關。氣虛或氣運不暢通，氣虛可致瘀，氣滯也致瘀，腎臟脈絡瘀阻，久瘀則積。腎主水，一旦腎臟受損，不可避免地導致水液代謝失調，津液不暢，濕邪與毒邪內停。日久成痰，痰伏于腎絡，日久積聚生成痰毒、瘀毒，而導致微型癥積[13]。
　　腎臟固有的成纖維樣細胞包括系膜細胞、間質成纖維細胞等，其中TGF-β1是重要的誘導因素，腎纖維化進展的多種途徑可誘導成纖維細胞激活為肌纖維母細胞表型。TGF-β1可以誘導成纖維細胞增殖，膠原蛋白的產生，阻斷TGF-β1可以延緩腎纖維化的進程[14-17]。肌成纖維細胞能夠分泌大量的ECM，包括FN，Col-I等[18]。TGF-β1刺激成纖維細胞，一方面增加ECM成分合成，另一方面通過抑制基質金屬蛋白酶（MMPs）表達來抑制ECM降解[19-20]。TGF-β1能夠直接增強腎小管上皮細胞-間充質細胞轉分化，引起細胞外基質的異常積聚和腎小球基底膜的增厚，導致腎纖維化[21-22]。TGF-β1有I型受體（TβR-I）、II型受體（TβR-II）和III型受體（TβR-III），其中Smad2/3是TGF-β1通路下游的重要遞質，也是主要的效應蛋白，其在腎小球硬化和腎間質纖維化中起著非常重要的作用[23-26]。當TGF-β1受體被激活時，P-Smad 2和P-Smad 3可以與Smad 4結合，復合物的形成轉移到細胞核中以調節下游基因轉錄[27-28]。大黃素作為中藥大黃活性成分之一，是中藥大黃蒽醌類物質，有減輕腎臟損傷的功能，且具有顯著的抗腎臟纖維化的作用[29-31]。Ⅰ型膠原蛋白是ECM的主要成分，當機體保護炎性反應受損的組織時，成纖維細胞異常性聚集活化，許多細胞因子開始刺激成纖維細胞分泌膠原蛋白，諸如I型膠原蛋白等等，因此說腎纖維化是I型膠原在腎小球和腎小管過度表達的最終結果[32-34]。
　　本實驗中，外源性的TGF-β1刺激成纖維細胞株活化，結果顯示與空白對照組比較，模型組（單純TGF-β1刺激組）成纖維細胞大量增殖，FN，Col-I，Smad 2/3蛋白及基因分泌明顯增加。大黃素組較模型組FN，Col-I，Smad 2/3蛋白及基因表達明顯降低，表明大黃素可以抑制NRK-49F成纖維細胞的增殖;且大黃素濃度越高，抑制作用越強，又說明大黃素能夠有效延緩慢性腎纖維化的進展。在后期研究中，本課題組將對大黃素對其他膠原蛋白和TGF-β1信號通路下游作進一步研究，以開發其在臨床的應用價值。
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　?。?019-04-10收稿 責任編輯：王明）
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