芒柄花黃素對實驗小鼠免疫功能的影響

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　　摘要 [目的]研究芒柄花黃素對實驗小鼠免疫功能的影響。[方法] 取SPF級雄性昆明小鼠40只，隨機分為低、中、高劑量芒柄花黃素試驗組和對照組，連續注射芒柄花黃素4周后檢測各組小鼠巨噬細胞的吞噬功能、小鼠脾細胞凋亡率及轉化率、小鼠血清中溶菌酶、IgG、IFN-γ及IL-4的含量。[結果] 中、高劑量芒柄花黃素組小鼠巨噬細胞吞噬率及血清溶菌酶含量高于對照組及低劑量組，差異顯著（P<0.05）。低、中、高劑量芒柄花黃素組小鼠脾細胞凋亡率低于對照組，差異顯著（P<0.05）。中、高劑量組小鼠脾細胞轉化率高于低劑量組及對照組，差異顯著（P<0.05）。中、高劑量芒柄花黃素組小鼠血清IgG含量高于對照組及低劑量組，差異顯著（P<0.05）。低、中、高劑量芒柄花黃素組小鼠血清中IL-4含量高于對照組，差異顯著（P<0.05），而小鼠血清中IFN-γ含量在各組間差異不顯著（P>0.05）。[結論]芒柄花黃素可以提高小鼠的固有免疫功能，抑制脾細胞凋亡并提高其轉化率。
　　關鍵詞 芒柄花黃素;脾細胞;固有免疫
　　中圖分類號 S852.4文獻標識碼 A
　　文章編號 0517-6611（2019）10-0086-03
　　Abstract [Objective] To study the effects of formononetin on the immune functions of mice. [Method] 40 male Kunming mice （SPF class） were divided into 4 groups， including low dose group， middle dose group， high dose group and control group. The phagocytic function of macrophages，the apoptosis rate and conversion rate of spleen cells，the contents of lysozyme，
　　IgG， IFNγ， IL4 in the serum of mice were detected after injecting formononetin for four weeks continuously. [Result]The phagocytosis rate of macrophage and serum lysozyme content of mice in the mediumdose group and highdose group of formononetin were higher than those  in the control group and lowdose group， and the difference was significant （P<0.05）. The apoptosis rate of mice spleen cells in the lowdose group， mediumdose group and highdose group of formononetin was lower than that in the control group， and the difference was significant （P<0.05）.The transformation rate of spleen cells in the mediumdose group and hig dose group was higher than that in the lowdose group and the control group， and the difference was significant （P<0.05）. The serum IgG content of mice in the mediumdose group and highdose group of formononetin was higher than that in the control group and the low dose group，  and the difference was significant （P<0.05）. The content of IL4 in the serum of mice in lowdose group， mediumdose group and highdose group of formononetin were higher than those of the control group， and the differences were significant （P<0.05）， while the content of IFNγ in the serum of mice were not significant among different groups （P>0.05）. [Conclusion] Formononetin can improve the innate immune function， inhibit the apoptosis of spleen cells and improve their transformation rate in mice.
　　Key words Formononetin;Spleen cell;Innate immune
　　芒柄花黃素，又名芒柄花素、刺芒柄花素，是紅三葉草、雞血藤、黃芪等多種中草藥的活性成分之一[1]，芒柄花黃素因具有異黃酮結構而成為一種典型的植物雌激素[2]。目前研究表明芒柄花黃素在治療膀胱癌[3]、胃癌[4]等惡性腫瘤方面可以誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖。此外，芒柄花黃素可以通過減少自由基生成，增強抗氧化酶活性、調節能量代謝發揮抗疲勞作用[5]。筆者探討了芒柄花黃素對實驗小鼠免疫功能的影響，以期為芒柄花黃素的臨床應用提供理論依據。 　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 試劑。芒柄花黃素購自成都瑞芬思生物技術有限公司（純度>98%），TUNEL一步法凋亡檢測試劑盒、羊抗鼠IgG抗體、IL-4和IFN-γ免疫檢測試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司。
　　1.1.2 實驗動物。雄性昆明小鼠40只，SPF級，6～8周齡，體重（20.0±2.0）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證編號為SCXK（京）2017-0001，動物房許可證號為SYXK（冀）2015-0038，相對濕度為（60±5）%。試驗期間自由飲水，采食標準飼料。
　　1.1.3 動物分組。實驗小鼠適應性喂養7 d后，將小鼠按照體重編號，采用隨機數字法分為4組，分別為低、中、高劑量芒柄花黃素試驗組和對照組，每組10只。低、中、高劑量芒柄花黃素試驗組分別按照10、20和30 mg/（kg·d）的劑量肌肉注射芒柄花黃素溶液0.5 mL，對照組小鼠肌肉注射等體積生理鹽水，連續注射4 周。乙醚麻醉后心臟取血，1 500 r/min離心10 min后分離血清，備用。
　　1.2 方法
　　1.2.1 巨噬細胞吞噬功能的測定。肌肉注射4周后，于每只小鼠腹腔注射10%雞紅細胞懸液1 mL，30 min后腹腔注射生理鹽水1 mL，輕揉腹部，抽取腹腔液滴于潔凈載玻片上。自然干燥后，10%甲醇溶液固定10 min，瑞士染色后鏡檢。每張玻片計數100個巨噬細胞，按以下公式計算巨噬細胞吞噬率：
　　巨噬細胞吞噬率=（吞噬雞紅細胞的巨噬細胞個數/100）×100%。
　　1.2.2 血清溶菌酶含量的測定。將溶壁微球菌接種于瓊脂培養基上，37 ℃下培養24 h，收集菌苔，備用。將100 mL 1%磷酸鹽緩沖液瓊脂加熱熔化，待冷至55 ℃時加入溶壁微球菌菌液1 mL（每毫升瓊脂內含標準溶壁微球菌1 mg）混和均勻，注入無菌平皿，瓊脂凝固后，用打孔器在瓊脂板打孔，孔徑5 mm。取50 μL血清加入瓊脂孔內，以標準溶菌酶作為陽性對照，生理鹽水作為陰性對照。將平皿置于35 ℃培養12 h，測定瓊脂孔周圍溶菌環直徑，計算樣品血清中溶菌酶活性[6]。
　　1.2.3 小鼠脾細胞凋亡的測定。乙醚麻醉小鼠后，剪開腹腔，分離脾臟，去除其周圍脂肪組織及筋膜，放入盛有PBS的無菌平皿中，輕研脾臟，細胞篩過濾，使脾細胞分散成細胞懸液，將脾細胞懸液1 000 r/min離心力離心5 min，收集沉淀細胞，加入1 mL紅細胞裂解液，充分混勻，室溫放置1 min，加入PBS緩沖液，終止紅細胞裂解。加入PBS緩沖液，1 000 r/min離心5 min，以PBS重懸沉淀細胞涂片，冰浴孵育2 min后用PBS洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌。加入50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min。PBS洗滌，封片后熒光顯微鏡觀察并計數。
　　1.2.4 脾細胞轉化率檢測。以含10%胎牛血清的DMEM培養基重懸沉淀脾細胞，轉移至無菌細胞培養瓶，補充培養液至10 mL，加入1 000 μg/mL PHA 0.1 mL，置于37 ℃ 5% CO2孵箱培養72 h后涂片，自然干燥后甲醇固定3 min，吉姆薩染色后鏡檢。觀察100個淋巴細胞，計算淋巴母細胞所占百分率，即淋巴細胞轉化率[7]。
　　1.2.5 血清IgG含量的測定。將2 g瓊脂粉加入100 mL蒸餾水中，加熱熔化，置于56 ℃水浴箱中保溫，加入羊抗鼠IgG抗體（稀釋比例為1∶60），輕輕混勻后，取4 mL瓊脂均勻澆注于潔凈載玻片上，制成厚度約1.5 mm的羊抗鼠IgG抗體瓊脂板，待瓊脂凝膠完全凝固后，使用打孔器在瓊脂板上打孔，直徑3 mm，孔距20 mm。分別于瓊脂孔中加入20 μL 1∶4稀釋的待測血清及標準品，置于墊有潮濕紗布的托盤內，加蓋，37 ℃溫育18 h，測量沉淀環直徑，計算沉淀環面積，根據標準品的沉淀環面積，繪制標準曲線，計算樣品中IgG含量[8]。
　　1.2.6 血清IL-4和IFN-γ含量的測定。取待測血清標本和標準品50 μL分別加入96孔板內，各孔分別加入生物素標記的抗小鼠IL-4或IFN-γ抗體50 μL，37 ℃孵育60 min，洗板5次，甩去孔內殘留液體;各孔分別加入50 μL HRP標記親和素，37 ℃孵育30 min，洗板5次，甩去孔內殘留液體;加底物工作液50 μL，37 ℃避光孵育15 min，加終止液50 μL。連續波長酶標儀測定450 nm波長的吸光度值，繪制標準曲線，測定各組小鼠血清中IL-4和IFN-γ的含量。
　　1.3 數據統計與分析
　　使用SPSS 22.0統計軟件對試驗數據進行統計與分析，各組間均數比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準取雙側α=0.05。
　　2 結果與分析
　　2.1 芒柄花黃素對小鼠巨噬細胞吞噬功能和血清溶菌酶含量的影響
　　由表1可知，中、高劑量芒柄花黃素組小鼠巨噬細胞吞噬率及血清溶菌酶含量高于對照組及低劑量組，差異顯著（P<0.05）;低劑量芒柄花黃素組與對照組相比差異不顯著（P>0.05），中劑量組與高劑量組相比差異不顯著（P>0.05）。這說明中劑量及高劑量芒柄花黃素可以提高小鼠巨噬細胞吞噬率及血清溶菌酶含量。
　　2.2 芒柄花黃素對小鼠脾細胞凋亡及轉化率的影響
　　TUNEL法檢測小鼠脾細胞凋亡結果表明，低劑量、中劑量與高劑量芒柄花黃素組小鼠脾細胞凋亡率均低于對照組（P>0.05），中劑量組及高劑量組小鼠脾細胞凋亡率均低于低劑量組（P>0.05），結果見圖1及表2。淋巴細胞轉化試驗結果表明，中、高劑量組小鼠脾細胞轉化率高于低劑量組及對照組，差異顯著（P<0.05）;芒柄花黃素低劑量組與對照組、中劑量組與高劑量組淋巴細胞轉化率差異均不顯著（P>0.05）（表2）。這表明芒柄花黃素可以抑制小鼠脾細胞凋亡并提高其轉化率。 　　2.3 芒柄花黃素對小鼠血清中IgG、IL-4和IFN-γ含量的影響
　　單向瓊脂擴散試驗結果表明，中、高劑量芒柄花黃素組小鼠血清IgG含量高于對照組及低劑量組，差異顯著（P<0.05）;低劑量芒柄花黃素組與對照組、中劑量組與高劑量組血清IgG含量差異均不顯著（P>0.05）。ELISA結果顯示，低、中、高劑量芒柄花黃素組小鼠血清中IL-4含量均高于對照組，差異顯著（P<0.05）;中、高劑量芒柄花黃素組小鼠血清中IL-4含量均高于低劑量組，差異顯著（P<0.05）;中劑量芒柄花黃素組小鼠血清中IL-4含量與高劑量組差異不顯著（P>0.05）。小鼠血清中IFN-γ含量在各組間差異均不顯著（P>0.05），結果見表3。研究結果提示芒柄花黃素可以提高小鼠體液免疫功能，但對細胞免疫功能無影響。
　　3 討論
　　巨噬細胞處于機體固有免疫的第一道防線，在機體非特異性免疫應答中發揮重要作用[9]。巨噬細胞主要通過吞噬、
　　抗原提呈和分泌多種細胞因子發揮免疫應答及調節作用。在感染初期，巨噬細胞可通過直接吞噬并殺滅入侵病原體，參與抗感染免疫[10]。溶菌酶是一種具有溶解G-細菌能力的水解酶[11]，是巨噬細胞胞外殺菌作用的主要成分。溶菌酶通過水解細菌細胞壁中的肽聚糖，裂解細菌，從而清除入侵體內的病原體。因此，評價巨噬細胞吞噬功能與溶菌酶活性可反映機體固有免疫功能狀態[12]。該研究結果表明，低劑量芒柄花黃素對小鼠巨噬細胞吞噬功能及溶菌酶活性無明顯影響，而中、高劑量芒柄花黃素能夠提高巨噬細胞吞噬功能及溶菌酶含量，提示中等劑量以上芒柄花黃素可以增強實驗小鼠的固有免疫應答功能。
　　脾臟中淋巴細胞包括T細胞與B細胞，而T細胞與B細胞是人體主要的免疫細胞[13]。脾細胞數量及功能的相對穩定對于維持機體適應性免疫應答發揮重要作用。在一些誘發因素（如射線、藥物等）的作用下，可引起細胞凋亡率發生改變。減少病理性凋亡的發生有利于機體免疫系統的抗感染及抗腫瘤能力。此外，淋巴細胞在受到非特異性有絲分裂原（如PHA、ConA）刺激后，表現為細胞體積增大，代謝旺盛、蛋白質和核酸合成增加，轉化為淋巴母細胞。淋巴細胞轉化增殖能力越高，機體內效應淋巴細胞數目越多，因此淋巴細胞轉化率可反映淋巴細胞的免疫功能狀態[14]。TUNEL法檢測小鼠脾細胞凋亡結果表明，芒柄花黃素作用小鼠后小鼠脾細胞凋亡率降低，并且這種作用呈現劑量依賴性的特點。淋巴細胞轉化試驗結果表明，中、高劑量芒柄花黃素作用小鼠后小鼠脾細胞轉化率增加。研究結果提示芒柄花黃素可以降低小鼠脾細胞凋亡并提高其轉化率。
　　抗體是參與機體體液免疫的主要分子，其中IgG類抗體是血清中抗體的主要成分，占血清免疫球蛋白總量的75%～80%，具有抗病毒、抗菌、調理吞噬、抗毒素等作用，檢測IgG類抗體含量可反映機體的體液免疫功能狀態[15]。IL-4是一種重要的Th2型細胞因子，能夠促進B細胞增殖、活化、分化并合成免疫球蛋白[16]，在機體體液免疫反應中發揮重要作用正向調節作用[17]。IFN-γ主要是由Th1細胞分泌的細胞因子[18]，能夠干擾病毒復制，在機體細胞免疫應答中發揮重要調節作用[19]。該研究結果表明芒柄花黃素可以提高小鼠血清中IgG類抗體和IL-4含量，而芒柄花黃素對小鼠血清中IFN-γ含量無明顯影響。這提示芒柄花黃素可以增強機體體液免疫應答能力，而這種調節作用可能是通過上調Th2型細胞因子IL-4的分泌，從而增加脾細胞IgG類抗體的合成而實現的，而芒柄花黃素對實驗小鼠細胞免疫無影響。
　　綜上所述，芒柄花黃素可以提高實驗小鼠巨噬細胞的吞噬功能，促進溶菌酶的合成與分泌，增強小鼠的固有免疫功能。同時，芒柄花黃素還可以通過抑制脾細胞凋亡、增強脾細胞轉化增殖能力，提高Th1型細胞因子IL-4的分泌水平，從而促進B細胞IgG類抗體的合成，提高機體的體液免疫功能。然而，芒柄花黃素對機體細胞免疫功能無明顯影響。
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