HPV感染對宮頸免疫微環境的影響

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　　[摘要] 目的 比較高危型和低危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染后宮頸局部細胞因子和陰道微生態指標變化情況，分析不同HPV感染對宮頸局部免疫微環境的影響。 方法 收集2017年3月～2018年7月在湖南醫藥學院第一附屬醫院門診就診的婦女宮頸和陰道分泌物標本，用PCR-反向點雜交法檢測HPV，根據檢測結果將155例標本分為高危型HPV組（55例）、低危型HPV組（40例）和未感染HPV的對照組（60例），用酶聯免疫吸附試驗測定宮頸細胞保存液中的γ干擾素（IFN-γ）、白細胞介素4（IL-4）和IL-21含量，并按全國臨床檢驗操作規程做真菌、陰道滴蟲、線索細胞、清潔度和pH檢查。 結果 與對照組和低危型HPV組比較，高危型HPV組的IFN-γ和IL-21含量均顯著降低（P < 0.01），但IL-4含量顯著升高（P < 0.01）；與對照組比較，低危型HPV組的IFN-γ含量顯著降低（P < 0.01），但IL-4和IL-21含量比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。經相關性分析，高危型HPV組、低危型HPV組和對照組的IL-21與IFN-γ含量均呈正相關（r = 0.74，P < 0.01；r = 0.70，P < 0.01；r = 0.66，P < 0.01），高危型和低危型HPV組的IL-4與IFN-γ含量均呈負相關（r = -0.33，P < 0.05；r = -0.44，P < 0.01）；高危型HPV組的IL-21與IL-4含量呈負相關（r = -0.30，P < 0.05）。此外，三組間真菌、陰道滴蟲、線索細胞、清潔度和pH等微生態指標的比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。 結論 高危型HPV比低危型HPV感染后更易引起宮頸局部IL-4和IFN-γ的表達異常，可能與具有免疫促進作用的IL-21低表達有關。因此，維持宮頸局部正常免疫微環境、恢復機體的免疫調節功能對機體清除HPV、阻斷HPV的持續感染非常重要。
　　[關鍵詞] 人乳頭瘤病毒；免疫；微環境；細胞因子
　　[中圖分類號] R373.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）05（a）-0163-04
　　Effects of HPV infection on cervical immune microenviroment
　　GUI Fang1 HUANG Juan1 YANG Daqing2 LIU Liyan1
　　1.School of Laboratory Medicine， Hu′nan University of Medicine， Hu′nan Province， Huaihua 418000， China； 2.Department of Clinical Laboratory， the First Affiliated Hospital of Hunan University of Medicine， Hu′nan Province， Huaihua 418000， China
　　[Abstract] Objective To compare the changes of cervical local cytokines and vaginal microecological indicators after the infection of high-risk and low-risk human papillomavirus （HPV）， and to analyze the effects of different HPV infections on the cervical local immune microenvironment. Methods Collection in March 2017 to July 2018 in the First Affiliated Hospital of Hu′nan University of Medicine Outpatient Clinic women specimens of cervical and vaginal secretions was carried out， PCR - reverse dot hybridization method was used to detect HPV， according to the results， the 155 cases were divided into high risk type HPV group（55 cases）， low-risk HPV group （40 cases） and control group （60 cases）， who were not infected with HPV. Cervical cell preservation solution enzyme linked immunosorbent test was carried out in the gamma interferon （IFN-γ）， interleukin 4 （IL-4） and IL-21 content， and according to the national clinical inspection procedures， the fungi， vaginal trichomoniasis， clue cell， cleanliness， and pH checks were carried out. Results Compared with the control group and low-risk HPV group， the content of IFN-γ and IL-21 in high-risk HPV group was significantly decreased （P < 0.01）， but the content of IL-4 was significantly increased （P < 0.01）. Compared with the control group， the IFN-γ content of low-risk HPV group was significantly reduced （P < 0.01）， but the difference between IL-4 and IL-21 was not statistically significant （P > 0.05）. After correlation analysis， IL-21 was positively correlated with IFN-γ content in high-risk HPV group， low-risk HPV group and control group （r = 0.74， P < 0.01）， r = 0.70， P < 0.01； r = 0.66， P < 0.01）， IL-4 and IFN-γ contents in the high-risk and low-risk HPV groups were negatively correlated （r = -0.33， P < 0.05； r = -0.44， P < 0.01）； IL-21 was negatively correlated with IL-4 in the high-risk HPV group （r = -0.30， P < 0.05）. In addition， there were no statistically significant differences among the three groups in microecological indicators such as fungi， vaginal trichomonas， clue cells， cleanliness and pH （P > 0.05）. Conclusion High-risk HPV is more likely to cause abnormal expression of local IL-4 and IFN-γ in the cervix after HPV infection than low-risk HPV infection， which may be related to the low expression of IL-21 with immune-promoting effect. Therefore， it is very important to maintain the local normal immune microenvironment in the cervix and restore the immune regulatory function of the body to remove HPV and block the continuous infection of HPV. 　　[Key words] Human papillomavirus； Immune； Microenviroment； Cytokines
　　高危型人乳頭瘤病毒是引起宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宮頸癌的主要病因。人乳頭瘤病毒（HPV）感染在有性活動的人群中較為常見，大多數女性感染HPV后可自發清除病毒，僅少數發生持續感染并發展為宮頸癌[1]，感染的發生發展一方面取決于HPV的感染型別，另一方面與宮頸局部微環境的免疫功能密切相關[2-3]。宮頸局部免疫微環境與陰道微生態系統、黏膜免疫系統、免疫細胞及細胞因子水平和功能密切相關[4]。在免疫應答過程中，以γ干擾素（IFN-γ）、白細胞介素-4（IL-4）、IL-21為代表的細胞因子在細胞免疫、體液免疫和免疫調節中發揮著重要作用。據此，本研究通過觀察高危型和低危型HPV感染者宮頸局部IFN-γ、IL-4、IL-21水平和陰道微生態指標變化，進而分析不同HPV感染對宮頸局部免疫功能的影響及其機制，對阻斷HPV的持續感染和預防CIN具有重要意義。
　　1 材料與方法
　　1.1 一般資料
　　選擇2017年3月～2018年7月在湖南醫藥學院第一附屬醫院門診就診的女性作為研究對象。納入標準：①1周內無陰道用藥；②1周內未服用抗菌藥物；③1周內無性生活。排除標準：①月經期、妊娠期和哺乳期；②其他原因引起的陰道出血。同時，在分組時排除HPV多重感染情況。共篩選出155名受試者，年齡23～65歲，平均（40.81±9.53）歲，根據HPV分型檢測結果分為三組：未感染HPV的對照組60例，年齡23～63歲，平均（39.35±10.01）歲；高危型HPV組55例，年齡25～65歲，平均（41.25±8.85）歲；低危型HPV組40例，年齡25～62歲，平均（42.33±9.36）歲。三組人群的年齡比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。
　　1.2 儀器與試劑
　　ETC811型PCR儀（蘇州東勝興業科學儀器有限公司）；YN-H16型分子雜交儀（深圳市亞能生物技術有限公司）；MB-530型酶標儀（深圳市匯松科技發展有限公司）；PCR-反向點雜交法HPV基因分型檢測試劑盒（深圳市亞能生物技術有限公司，批號：QX201 817029）；Human IL-4、IL-21、IFN-γ ELISA試劑盒（深圳市雨朵生物技術有限公司，批號：E20171201A）。
　　1.3 標本采集
　　標本由婦科醫師采集，用鹽水濕潤的棉拭子在陰道上1/3處旋轉一圈，要求棉拭子與陰道的接觸時間不少于25 s，將棉拭子取出放入無菌試管中。另取一支棉拭子將宮頸口過多的分泌物擦去，再將一次性無菌宮頸采樣器伸入宮頸內順時針方向旋轉3～6圈，緩慢抽出宮頸刷，置于裝有細胞保存液的樣本管中，于2～8℃冰箱保存備用。
　　1.4 方法
　　1.4.1 HPV分型檢測 用PCR-反向點雜交法檢測HPV，基本步驟為：①HPV DNA的提取；②PCR擴增；③雜交；④洗膜；⑤顯色。所有操作步驟和結果判定均嚴格按試劑盒說明書要求進行。試劑盒檢測的23種HPV分為高危型和低危型二類，其中高危型HPV有16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82型，低危型HPV有6、11、42、43、81和83型。
　　1.4.2 細胞因子檢測 采用ELISA雙抗夾心法檢測宮頸細胞保存液中的IFN-γ、IL-4和IL-21含量。按照說明書步驟進行操作，在酶標儀上450 nm波長測定各孔OD值，結果判斷時應將各試驗孔OD值減去空白孔OD值。用試劑盒提供的標準品制作OD450值與濃度的標準曲線，計算出樣本中IFN-γ、IL-4和IL-21的含量。
　　1.4.3 陰道微生態指標檢測 ①病原體檢測：取陰道分泌物直接涂片，光學顯微鏡觀察有無真菌和陰道滴蟲感染；同時，將陰道分泌物涂片染色后鏡檢有無線索細胞，據此診斷細菌性陰道炎。②陰道清潔度檢測：將陰道分泌物做生理鹽水直接涂片、鏡檢，根據上皮細胞、白細胞、乳酸桿菌和雜菌數量比例分為Ⅰ～Ⅳ度，判定標準嚴格參照《全國臨床檢驗操作規程》第四版[5]。③陰道pH值檢測：采用精密pH試紙測定陰道分泌物的pH值。
　　1.5 統計學方法
　　采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。采用Pearson線性相關分析方法作兩變量間的相關分析。分類變量資料采用率或構成比來進行描述，組間比較采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。
　　2 結果
　　2.1 HPV感染組型別分布情況
　　根據該院各型HPV的檢出情況，分別選擇55例高危型HPV感染者和40例低危型HPV感染者作為試驗組，其中高危型HPV組包括16、18、31、33、39、45、51、52、53、56、58、59、68和82型；低危型HPV組包括6、11、42、43、81和83型。
　　2.2 三組IL-4、IFN-γ、IL-21含量比較
　　三組人群的IFN-γ、IL-4和IL-21含量比較，差異均有統計學意義（P < 0.01）。其中，與對照組和低危型HPV組比較，高危型HPV組的IFN-γ和IL-21含量均降低，但IL-4含量升高，差異均有統計學意義（P < 0.01）；與對照組比較，低危型HPV組的IFN-γ含量降低（P < 0.01），但兩組的IL-4和IL-21含量比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。
　　2.3 三組IL-4、IFN-γ、IL-21指標的線性相關分析 　　高危型HPV組、低危型HPV組和對照組的IL-21與IFN-γ含量均呈正相關（P < 0.01），高危型HPV組的IL-21與IL-4、IL-4與IFN-γ含量均呈負相關（P < 0.05），低危型HPV組的IL-4與IFN-γ含量呈負相關（P < 0.01）。見表2。
　　2.4 陰道微生態檢測結果
　　對高危型HPV組、低危型HPV組和對照組的陰道分泌物真菌、陰道滴蟲、線索細胞、pH值和清潔度檢查結果進行統計分析，三組間各指標的差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表3。
　　3 討論
　　HPV是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，現已發現100多個型別，其中至少有40余種亞型可造成女性生殖系統感染?，F已證明，高危型HPV的持續感染是導致CIN及宮頸癌的重要因素[6-7]。HPV感染在有性活動的人群中較為常見，機體感染HPV后大部分情況下可清除病毒，是否發生持續感染及感染后的轉歸與機體的免疫功能密切相關，其中，陰道和宮頸黏膜免疫系統是機體抵抗HPV感染的一道重要防線，其功能受局部微生態系統、免疫細胞和細胞因子等多種因素影響[8-10]。因此，了解宮頸局部微環境改變有助于探討HPV持續感染并導致CIN及癌變的可能機制，可為宮頸癌的防治提供新思路。
　　本研究發現，與未感染HPV的對照組比較，高危型HPV感染者宮頸局部IL-4含量明顯升高，而IFN-γ含量顯著降低。在免疫應答過程中，IFN-γ和IL-4是二種重要的免疫效應分子，IL-4主要由Th2細胞分泌，能促進Th2細胞的增殖，發揮體液免疫效應，并抑制Th1細胞增殖；IFN-γ則主要由Th1細胞分泌，能促進Th1細胞的增殖，發揮細胞免疫效應，同時抑制Th2細胞增殖。因此，IFN-γ和IL-4含量的變化提示高危型HPV感染有可能導致Th1型細胞免疫應答向Th2型體液免疫應答漂移，這與其他研究[11-12]一致。
　　Th1/Th2漂移的形成機制目前尚不明確。本研究發現，高危型HPV感染后宮頸局部IL-21含量降低，并與IFN-γ含量呈正相關，而與IL-4含量呈負相關。IL-21是IL-2細胞因子的一個家族成員，主要由活化的CD4+T細胞、濾泡輔助性T細胞、輔助性T細胞17、自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）等免疫細胞分泌產生，也可由纖維細胞等非免疫細胞產生，其受體分布廣泛[13]，具有重要的免疫調節功能，能增強CD8+T細胞和NK細胞的細胞毒作用[14]、促進IFN-γ的分泌及抗體的產生，并有助于T細胞抵抗Treg細胞的免疫抑制作用，進而加強T細胞活性[15]。因此，宮頸局部IL-21減少提示患者的免疫調節功能出現異常，這可能是引起Th1/Th2漂移的原因之一，并由此導致IFN-γ的分泌減少、T細胞和NK細胞的細胞毒活性降低，使機體的抗病毒和抗腫瘤功能下降，進而引起HPV的持續感染和CIN。
　　此外，與高危型HPV感染不同的是，低危型HPV感染后僅IFN-γ含量減少，而IL-4和IL-21含量無明顯改變，提示機體的抗病毒功能雖有下降，但可能尚未出現明顯的Th細胞漂移，因此更有利于機體清除病毒，不易出現HPV的持續感染。
　　HPV的持續感染除與免疫系統密切相關外，還與陰道微生態系統有關[16-17]。本研究發現，高危型和低危型HPV感染者陰道局部真菌、陰道滴蟲、線索細胞、pH值、清潔度等指標與對照組比較均差異無統計學意義（P > 0.05），這與其他報道[18-20]不盡相同。其原因可能是標本來源有差異，例如患者感染的HPV型別、年齡分布、標本的采集時間等都可影響實驗結果，對此尚需做進一步研究。
　　綜上所述，HPV感染與宮頸免疫微環境之間相互作用、相互影響，高危型HPV比低危型HPV感染后更易引起宮頸局部IL-4和IFN-γ的表達異常，推測局部可能發生Th1/Th2漂移，其原因可能與具有免疫促進作用的IL-21低表達有關。局部細胞免疫功能下降有利于HPV的持續增殖，進而引起宮頸出現病理性改變甚至CIN。因此，維持宮頸局部正常免疫微環境、恢復機體的免疫調節功能對機體清除HPV和預防CIN具有非常重要的臨床意義。
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　?。ㄊ崭迦掌冢?018-11-12 本文編輯：封 華）
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