GNB2L1對惡性黑素瘤細胞增殖和遷移的影響

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　　[摘要]目的：探討支架蛋白重組人鳥嘌呤核苷酸結合蛋白beta多肽2樣蛋白1（guanine nucleotide-binding protein subunit Beta 2-like 1，GNB2L1）對小鼠惡性黑素瘤B16F10細胞增殖和遷移的影響。方法：用靶向GNB2Ll的短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒液和空載體慢病毒液感染惡性黑素瘤B16F10細胞，分別獲得穩定感染細胞株B16F10-GNB2L1-shRNA（陽性實驗組）和B16F10-NC（陰性對照組），未感染病毒液的細胞株B16F10設為空白對照組。Western blot檢測GNB2Ll以及上皮間質轉化標志蛋白E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）的表達水平;CCK-8檢測細胞的增殖能力;劃痕實驗檢測細胞的遷移能力。結果：與B16F10和B16F10-NC相比，B16F10-GNB2L1-shRNA中GNB2Ll蛋白表達水平明顯下調;GNB2L1敲降可明顯抑制B16F10細胞的增殖和劃痕遷移能力;Western blot特異性抗體檢測發現GNB2L1敲降的細胞中N-cadherin的蛋白表達水平明顯降低，而E-cadherin的蛋白表達水平明顯升高。結論：下調GNB2Ll蛋白表達可有效抑制惡性黑素瘤B16F10細胞的增殖和遷移能力。
　　[關鍵詞]GNB2Ll;惡性黑素瘤;shRNA;上皮間質轉化;增殖;遷移
　　[中圖分類號]R739.5    [文獻標志碼]A    [文章編號]1008-6455（2019）06-0059-05
　　Abstract： Objective  To investigate the effect of scaffold protein Guanine nucleotide-binding protein subunit Beta 2-like 1 （GNB2L1） on proliferation and migration of mouse malignant melanoma B16F10 cells. Methods  Malignant melanoma B16F10 cells were infected with short hairpin RNA （shRNA） lentiviral solution and empty vector lentiviral solution targeting GNB2L1 to obtain stable infected cell line B16F10-GNB2L1-shRNA （positive experimental group） and B16F10-NC （negative control group）， cell line B16F10 not infected with virus solution was set as a blank control group. Western blot was used to detect the expression levels of GNB2L1 and epithelial-mesenchymal transition marker proteins E-cadherin and N-cadherin; CCK-8 was used to detect the cells proliferation ability; scratch test was used to detect cells migration ability. Results  Compared with B16F10 and B16F10-NC， the expression of GNB2L1 protein was down-regulated in B16F10-GNB2L1-shRNA; GNB2L1 knockdown significantly inhibited the proliferation and scratch migration ability of B16F10 cells; Western blot specific antibody detection found that GNB2L1 knockdown the expression level of N-cadherin protein was significantly decreased in cells， while the expression level of E-cadherin protein was significantly increased. Conclusion  Down-regulation of GNB2L1 protein expression can effectively inhibit the proliferation and migration of malignant melanoma B16F10 cells.
　　Key words： GNB2Ll; malignant melanoma; shRNA; EMT; proliferation; migration
　　惡性黑素瘤（malignant melanoma，MM）是一種來源于黑素細胞的侵襲性皮膚惡性腫瘤，盡管其發病率僅占所有皮膚病的4%，卻占皮膚腫瘤相關死亡疾病的90%，是皮膚癌相關死亡的最主要原因[1]，發病率和死亡率呈逐年上升趨勢。2018年最新癌癥統計數據顯示美國皮膚惡性黑素瘤新增病例91 270例[2]，相比2017年癌癥統計[3]顯示的惡性黑素瘤新增病例87 110例要高。而且惡性黑素瘤在我國發病率近年來成倍增長，每年新發病例約2萬人[4]，已經成為嚴重危及我國人民健康的疾病之一。 　　GNB2L1又稱激活的蛋白激酶C受體1（receptor for Activated C Kinase l，RACKl），是一種36KDa的蛋白質，屬于色氨酸-天冬氨酸重復序列（tryptophan-aspartate repeat，WD-repeat）β-螺旋槳蛋白家族成員，含有7個WD-40的重復序列，高度保守地存在于哺乳動物和人類的肝、腦和脾等組織中。GNB2L1屬于支架蛋白，被認為是多種功能信號通路的樞紐，提供蛋白質-蛋白質相互作用的平臺，并在細胞的生長、黏附、增殖、侵襲和遷移等過程中發揮重要的作用。目前已有研究表明GNB2L1在多種腫瘤細胞中表達上調，包括乳腺癌[5]、非小細胞肺癌[6]、結腸癌[7]、腦膠質瘤[8]和胰腺導管腺癌[9]等，被認為不良預后的因素。由此可見，GNB2L1在腫瘤細胞的產生、增殖、分化、惡變、侵襲和遷移等方面發揮著關鍵的調節作用。因此，筆者推測GNB2L1支架蛋白可能參與了惡性黑素瘤的發生與發展過程，對惡性黑素瘤的增殖和遷移等生物學行為發揮了重要的調控作用。
　　1  材料和方法
　　1.1 主要試劑與儀器：DMEM細胞培養基、胎牛血清、PBS緩沖液及0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國）;GNB2L1 shRNA和NC shRNA（金維智生物科技有限公司，中國）;Lipofectamine2 000 （Invitrogen公司，美國） ;兔RACK1單克隆抗體、兔N-cadeherin 多克隆抗體和鼠E-cadeherin 單克隆抗體（Abcam公司，美國）;鼠β-actin單克隆抗體、鼠GAPDH單克隆抗體、增強型CCK-8試劑盒（上海Beyotime生物技術有限公司，中國）;HRP標記山羊抗兔IgG和抗鼠IgG抗體（Cell Signaling公司，美國）;RIPA細胞裂解液（北京索萊寶技術有限公司，中國）;BCA法蛋白濃度檢測試劑盒（Thermo公司，美國）;基本型ECL發光底物A液、B液（上海圣爾生物科技有限公司，中國）;質粒中抽試劑盒（天根生化科技北京有限公司，中國）;NcmDH5α感受態細胞（新賽美生物科技有限公司，中國）;CO2恒溫培養箱（Haier公司，中國）;Mini-P TET蛋白電泳系統、凝膠成像系統GelDoc XR+ （Bio-Rad公司，美國）;電泳轉移槽（上海Tanon有限公司，中國）;多功能酶標儀Infinite M200 Pro（Tecan公司，瑞士）。
　　1.2 細胞培養：惡性黑素瘤B16F10細胞源自上海復旦大學生命科學院重點實驗室，用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養基在37℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養箱中培養，隔天換液1次。當細胞鋪滿培養瓶底壁面積的80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。
　　1.3 GNB2L1干擾寡核苷酸序列的合成和慢病毒包裝：將針對GNB2L1干擾靶點的shRNA序列克隆到慢病毒表達載體質粒上，正義鏈：5'-CACCGAGATAAGACCATCATCATGTTTCAAGAGAACATGATGATGGTCTTATCTCTTTTTTG-3'，反義鏈：5'-AGCTCAAAAAAGAGATAAGACCATCATCATGTTCTCTTGAAACATGATGATGGTCTTATCTC-3'。293T細胞接種于6cm培養皿中，將病毒包裝質粒和核心質粒與Lipofectamine 2 000脂質體混合，質粒質量：脂質體體積比為1：2，加入適量的無血清的OPTI培養基，輕輕晃動培養皿使其充分混勻，置于37℃、CO2恒溫培養箱孵育，6～8h后更換含有血清的新鮮完全培養基，培養48h后收集上清液。
　　1.4 慢病毒轉染細胞：B16F10細胞接種于6孔板，置于37℃、5% CO2恒溫培養箱孵育，當細胞貼壁后，所占面積達80%～90%時，吸棄6孔板舊的培養基，加入新收集的病毒液繼續感染24h。更換新鮮的完全培養基，加入嘌呤霉素，使其濃度為1.5?g/ml，篩選嘌呤霉素抗性基因表達陽性的細胞，無嘌呤霉素抗性基因的細胞被殺死，每天更換新鮮的含有嘌呤霉素的培養基，以獲得轉染GNB2L1 shRNA序列的細胞株（B16F10-GNB2L1-shRNA），用于后續實驗。
　　1.5 CCK8測量細胞增殖活性：將生長對數期B16F10細胞接種至96孔板，接種濃度1 500個/孔，每孔150?l培養基，每組6個復孔。將96孔板置于37℃、5% CO2恒溫培養箱培養24h后，當細胞融合率達80%～90%，每孔加入150?l的CCK-8溶液，繼續培養2h，用酶標儀測波長為450nm的OD值。
　　1.6 劃痕試驗：將B16F10細胞接種于6孔板，每組3個復孔，在6孔板底面的外壁用標記筆劃縱向黑線，用黃色槍頭在細胞上垂直于縱向黑線劃痕，PBS緩沖液沖洗清除劃下的細胞，加入無血清的DMEM細胞培養基，在倒置顯微鏡下拍照，記為0h。將細胞放入37℃、5% CO2培養箱繼續培養24～48h，利用倒置顯微鏡，保持與0h拍照一致的位置，記錄24h和48h劃痕寬度變化。
　　1.7 Western blot檢測E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）表達水平：RIPA細胞裂解液裂解細胞提取轉染GNB2L1 shRNA的蛋白，根據BCA法蛋白濃度檢測試劑盒說明書在570nm波長處測量蛋白標準品的OD值，制作蛋白標準品的標準曲線，算出待測蛋白濃度，SDS樣品緩沖液（5×）100℃加熱5min，使蛋白變性。配膠完成后上樣，電泳分離，將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，含4%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1h，再分別與E-cadherin和N-cadherin一抗（ 稀釋比分別為1‥2 000和1‥3 000） 及GAPDH一抗（ 稀釋比為1：1 000） 4℃溫育過夜。TBST緩沖液洗膜3次，HRP耦聯的IgG作為二抗（稀釋比為1：10 000）室溫溫育1h，重復洗膜3次，ECL發光法顯色，利用Image Lab軟件進行圖像分析。 　　1.8 統計學分析：采用Graphpad prism 6軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差（x?±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。
　　2  結果
　　2.1 GNB2L1 shRNA的B16F10細胞下調GNB2L1支架蛋白的表達：與空白組B16F10和陰性對照組B16F10-NC相比，B16F10細胞穩定轉染GNB2L1 shRNA中GNB2L1支架蛋白的條帶顏色明顯較淺（見圖1）。該結果顯示B16F10-GNB2L1-shRNA組細胞的GNB2L1表達量明顯下降，表明GNB2L1 shRNA轉染成功，GNB2L1敲除成功。
　　2.2 穩定轉染GNB2L1 shRNA的B16F10細胞增殖活性顯著下降：在相同初始接種濃度下和觀察時間段內（24～72h），三組的OD值持續增加，48～72h的增加速率高于24～48h增加速度;其中空白組B16F10細胞和陰性對照組B16F10-NC細胞的OD值增加速率接近，都較B16F10-GNB2Ll-shRNA細胞的OD值高;尤其在接種72h后，空白組B16F10細胞的OD值顯著高于實驗組B16F10-GNB2Ll-shRNA細胞，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05）;盡管此時陰性對照組B16F10-NC細胞的OD值亦較高，與空白對照組B16F10細胞的OD值相比，兩組差異不明顯，無統計學意義（P>0.05）（見表1，圖2）。該結果證實穩定轉染GNB2L1 shRNA的B16F10細胞增殖活性顯著下降。
　　2.3 穩定轉染GNB2L1 shRNA的B16F10細胞的遷移速度顯著減慢：劃痕實驗顯示起始狀態下三組的劃痕寬度近似，隨著時間的推移劃痕間距明顯減?。ㄒ妶D3）。在24h，B16F10空白組細胞遷移率（82.67±1.4530）和B16F10-NC陰性對照組細胞遷移率（75.00±1.7320）比實驗組B16F10-GNB2Ll-shRNA細胞的遷移率（33.00±1.7320）顯著增加，兩組之間的差異具有統計學意義（P<0.05）;特別在48h，B16F10空白組細胞遷移率（91.67±1.6670）與B16F10-NC陰性對照組細胞遷移率（91.33±2.1860）較實驗組B16F10-GNB2Ll-shRNA細胞的遷移率（41.33±1.8560）顯著增加，B16F10空白組細胞和B16F10-NC陰性對照組細胞幾乎填滿整個劃痕空隙，兩組之間的差異都具有統計學意義（P<0.05）;B16F10空白組細胞遷移率和B16F10-NC陰性對照組細胞遷移率之間無明顯差異（P>0.5）（見圖4）。該實驗結果表明穩定轉染GNB2L1shRNA能顯著抑制鼠黑素瘤B16F10細胞的遷移運動能力。
　　
　　2.4 穩定轉染GNB2L1 shRNA的B16F10細胞中E-cadherin蛋白表達水平：Western blot分析結果發現，B16F10-GNB2L1-shRNA細胞內E-cadherin蛋白的表達量（0.8654±0.0331）明顯高于空白對照組B16F10細胞（0.1234±0.0179），差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖5。
　　2.5 穩定轉染GNB2L1 shRNA的B16F10細胞中N-cadherin蛋白表達水平：B16F10-GNB2L1-shRNA細胞內N-cadherin蛋白的表達量（0.01081±0.0007）明顯低于空白對照組B16F10細胞（0.2309±0.0295），差異有統計學意義（P<0.05）;而陰性對照組B16F10-NC細胞內N-cadherin細胞的表達量（0.1943±0.0228）與空白對照組B16F10的表達量無統計學差異（P>0.05）。見圖6。
　　3  討論
　　早期發生遠處轉移是導致大多數黑素瘤患者死亡的主要原因，轉移性黑素瘤患者的中位生存時間為8～9個月，3年總體生存率不足15%[10]。轉移性黑素瘤是人類第五大最常見并被診斷的癌癥[11]之一。惡性黑素瘤的高轉移特性一直是其治療的難點，盡早發現并阻斷惡性黑素瘤的轉移成為提高患者生存率的關鍵因素。因此，尋找一種靶向惡性黑素瘤轉移的位點對提高患者治療效果和預后發揮重要作用。
　　腫瘤轉移是一個復雜的多步驟過程，涉及到腫瘤細胞與宿主之間的相互作用。腫瘤細胞通過改變自身細胞骨架和細胞外基質結構，黏附、侵襲和轉移到周圍組織、血管和淋巴管而進入血液循環并向遠處組織和器官播散遷移。本實驗研究顯示下調GNB2L1支架蛋白的表達后，B16F10-GNB2L1-shRNA組與兩對照組相比，細胞增殖活性明顯受到抑制;劃痕實驗結果也表明B16F10-GNB2L1-shRNA組的細胞爬滿劃痕的速率明顯低于對照組。根據這些結果推斷GNB2L1在促進惡性黑素瘤細胞的增殖和遷移中發揮著重要的作用。
　　上述發現與以往報道中觀察到的GNB2L1在其他腫瘤細胞中的作用一致，例如Shen等[12]研究表明GNB2L1在體外和體內均促進前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，通過siRNA對GNB2L1敲低抑制了前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移。Peng等[13]研究表明GNB2L1在鼻咽癌組織中高表達，GNB2L1的過表達促進鼻咽癌細胞的增殖、侵襲和遷移，而下調GNB2L1則抑制鼻咽癌細胞的增殖、侵襲和遷移。Hu等[14]GNB2L1在食管鱗狀細胞癌中上調，GNB2L1的過表達促進食管鱗狀細胞癌的增殖和遷移，而GNB2L1的下調在體內和體外均抑制其增殖和遷移。Li等[15]研究表明GNB2L1在口腔鱗狀細胞癌中的沉默不僅可抑制細胞的增殖，還可抑制腫瘤細胞的侵襲、遷移和黏附的能力。
　　上皮細胞-間質轉化（EMT）是上皮細胞獲得運動遷移能力的一個重要途徑，是促使細胞脫離原發病灶的關鍵步驟。發生EMT改變后不僅可以下調腫瘤細胞連接分子的表達，導致細胞極性缺失，細胞黏附能力下降、運動性提高、侵襲能力增強，還可以通過改變腫瘤生長狀態、侵襲和轉移以及血管形成的微環境，增強腫瘤侵襲和轉移能力[16]。此外，EMT還參與細胞外基質和基底膜溶解，破壞組織之間正常的屏障，進入血液或淋巴循環，在種植部位形成轉移瘤[17]。因此，EMT是腫瘤細胞發生侵襲和遠處轉移的基礎。在EMT的過程中通常伴隨著E-cadherin上皮細胞標志物表達的下調和N-cadherin等間質表型標志物表達的上調。 　　E-cadherin是一種介導同型細胞-細胞間黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，在維持上皮細胞形態結構的完整性和極性中發揮重要的作用。在上皮細胞中E-cadherin正常表達，當E-cadherin表達下降時，上皮細胞之間會失去正常極性，發生黏附缺失，從而從上皮表型轉變為間質表型，導致腫瘤細胞發生侵襲和轉移。因此，E-cadherin也稱為惡性腫瘤的侵襲和轉移的抑制因子。而N-cadherin與E-cadherin相反。N-cadherin主要在細胞質中高表達，不表達于正常的上皮組織。當上皮組織中N-cadherin表達上調，導致上皮細胞的形態和生物學行為發生改變，促進細胞侵襲和遷移，即發生EMT。大量研究表明在惡性腫瘤中E-cadherin表達的缺失通常伴隨著N-cadherin表達的上調，E-cadherin和N-cadherin作為代表性的EMT標志物，與患者不良預后有關，包括膠質瘤[18]、口腔鱗狀細胞癌[19]、膀胱移行細胞癌[20]和喉鱗狀細胞癌[21]等。本研究通過Western blot實驗特異性地檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白表達水平，發現敲低GNB2L1支架蛋白的表達后，E-cadherin蛋白表達水平顯著升高，而N-cadherin蛋白表達水平明顯降低。該結果與以往報道一致，這意味著GNB2L1調控這兩種蛋白表達，并可能在促進惡性黑素瘤細胞發生上皮間質轉化中起著重要的作用，進而促進腫瘤細胞的侵襲和遠處轉移。因此，研究E-cadherin和N-cadherin在EMT過程中的相關機制有助于了解惡性黑素瘤細胞的侵襲和遠處轉移的生物學行為。
　　綜上所述，筆者研究數據表明GNB2L1支架蛋白在惡性黑素瘤中表達，通過下調支架蛋白GNB2L1的表達可以有效抑制惡性黑素瘤細胞的增殖和遷移能力，并可能通過上調E-cadherin和下調N-cadherin抑制惡性黑素瘤細胞發生上皮細胞-間質轉化實現的。因此，GNB2L1有望成為評估惡性黑素瘤發生、發展和遷移的臨床生物標志物，并可能為惡性黑素瘤提供新的治療靶點。
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　　[收稿日期]2018-11-19
　　本文引用格式：鄭舒丹，程詩萌，董亞兵，等.GNB2L1對惡性黑素瘤細胞增殖和遷移的影響[J].中國美容醫學，2019，28（6）：59-63.
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