青藤堿對兔膝骨關節炎模型組織形態學及關節液炎性細胞和聚集蛋白聚糖酶含量的影響

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　　 摘要：目的  觀察不同劑量青藤堿對兔膝骨關節炎（OA）模型關節軟骨和滑膜組織形態學及關節液白細胞介素（IL）-6、IL-17及聚集蛋白聚糖酶（ADAMTS）-4、ADAMTS-5含量的影響。方法  采用Hulth法建立OA模型。將50只新西蘭大白兔隨機分為空白組、模型組和青藤堿低、中、高劑量組?？瞻捉M不予任何處理，模型組給予生理鹽水、給藥組給予鹽酸青藤堿注射液膝關節腔注射，共干預10次，青藤堿給藥量分別為0.2 mL（5 mg）、0.35 mL（8.75 mg）和0.5 mL（12.5 mg）。干預結束后取關節軟骨行番紅O染色，取滑膜組織行HE染色，進行組織學評分;ELISA檢測關節液IL-6、IL-17、ADAMTS-4和ADAMTS-5含量。結果  模型組軟骨Mankin’s評分和滑膜組織病理學評分顯著高于空白組（P<0.01），青藤堿中、高劑量組軟骨Mankin’s評分和滑膜評分顯著低于模型組（P<0.05，P<0.01）;模型組關節液IL-6、IL-17、ADAMTS-4和ADAMTS-5含量較空白組顯著升高（P<0.01），青藤堿中、高劑量組關節液IL-6、IL-17、ADAMTS-4和ADAMTS-5含量較模型組顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結論  中、高劑量青藤堿對OA模型病變軟骨具有保護作用。
　　 關鍵詞：青藤堿;骨性關節炎;白細胞介素-6;白細胞介素-17;聚集蛋白聚糖酶;兔
　　 中圖分類號：R285.5    文獻標識碼：A    文章編號：1005-5304（2019）06-0051-04
　　 Abstract： Objective To observe the effects of different concentrations of sinomenine （SIN） on morphology of synovium and cartilage and contents of IL-6， IL-17， ADAMT-4 and ADAMT-5 in synovial fluid of rabbit knee osteoarthritis model. Methods After establishing the knee osteoarthritis model by Hulth method， the New Zealand white rabbits were randomly divided into control group， model group， SIN low-， medium- and high-dosage groups. Control group did not receive any treatment. Model group and other administration group received saline and SIN knee joint injection， for 10 times. The dosages of SIN were 0.2 mL （5 mg）， 0.35 mL （8.75 mg）， and 0.5 mL（12.5 mg）， respectively. After intervention， the articular cartilage was stained with Safranin O， and the synovium was taken for HE staining and histological scoring. The levels of IL-6， IL-17， ADAMTS-4 and ADAMTS-5 in joint fluid were detected by ELISA. Results Mankin’s scores of articular cartilage and histological scores of synovium in model group were significantly higher than control group （P<0.01）， and the Mankin's score and synovial score in SIN medium- and high-dosage groups were significantly lower than those in the model group （P<0.05， P<0.01）. The levels of IL-6， IL-17， ADAMTS-4 and ADAMTS-5 in the model group were significantly higher than those in the control group （P<0.01）. The levels of IL-6， IL-17， ADAMTS-4 and ADAMTS-5 in SIN medium- and high-dosage groups were significantly lower than those in the model group （P<0.05， P<0.01）. Conclusion SIN medium and high dosage can delay the degradation of articular cartilage of osteoarthritis model.
　　 Keywords： sinomenine; osteoarthritis; IL-6; IL-17; ADAMTS; rabbits
　　 骨性關節炎（osteoarthritis，OA）通常被視為因增齡及生物力學機制改變等因素引起的，以關節軟骨損傷為中心并累及關節周圍多種組織的退行性關節病。近年研究發現，包括滑膜炎性反應在內的生物學因素在OA進程中發揮重要作用，滑膜炎不僅是引起OA患者關節腫痛、關節功能障礙的重要因素，且與軟骨退變程度及骨贅形成密不可分[1]。應用高分辨率成像模式及關節鏡可視化技術的研究發現，滑膜炎在OA關節軟骨退變發生之前就已出現[2]。對有臨床癥狀但無影像學改變的OA患者動態膝關節鏡檢查顯示，滑膜炎與膝關節內側軟骨丟失的未來發展聯系緊密[3]。磁共振成像研究也得出類似結果，即滑膜炎性反應程度與OA進程密切相關[4]。青藤堿是從防己科藤本植物青風藤中提取的生物堿單體，為青風藤的主要活性成分。我們前期實驗研究發現，青藤堿具有抑制木瓜蛋白酶誘導的兔膝OA滑膜炎性反應及保護關節軟骨的作用[5]。本研究進一步觀察不同劑量青藤堿對Hulth法誘導膝OA模型兔關節液炎癥因子白細胞介素（IL）-6、IL-17及帶有血小板凝血酶敏感蛋白結構域的解聚素與金屬蛋白酶家族成員中聚集蛋白聚糖酶（ADAMTS）-4、ADAMTS-5含量，以及關節滑膜和軟骨組織形態學的影響，為青藤堿在OA的臨床應用提供依據。 　　1  材料與方法
　　1.1  動物與分組
　　 新西蘭大白兔50只，雌雄各半，體質量2.0～2.4 kg，西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK（陜）2014-003。標準飼料、單籠喂養，室溫20～25 ℃，相對濕度45%～60%，每日正常光照，自由攝食飲水。適應環境1周后，隨機分為空白組、模型組和青藤堿低、中、高劑量組，每組10只。
　　1.2  藥物、試劑與儀器
　　 鹽酸青藤堿注射液，湖南正清制藥集團股份有限公司，批號1607405;IL-6、IL-17、ADAMTS-4和ADAMTS-5 ELISA試劑盒，北京諾博萊科技有限公司;Bio-Tec ELX808型酶標儀（美國Bio-Tec公司），超薄切片機（德國LEICA公司），ZEISS研究級正置數碼顯微鏡（德國ZEISS公司）。
　　1.3  造模
　　 采用Hulth法[6]建立兔膝OA模型。10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，將兔仰臥后固定右膝關節于屈曲位，膝關節剪毛、常規消毒，采用內側切口暴露關節腔，直視下切除內側半月板，切斷前、后交叉韌帶，生理鹽水沖洗切口，使用4-0號縫線逐層關閉切口，術后注射青霉素預防傷口感染。術后6周隨機處死2只兔行關節軟骨病理學檢查，結果顯示典型軟骨退變，同時行為學觀察發現兔右膝關節出現腫脹、跛行，表明造模成功。按鹽酸青藤堿注射液成人用藥劑量（2 mL/次），按Meeh-Rubner公式計算人兔等效劑量。青藤堿低、中、高劑量組膝關節腔注射鹽酸青藤堿注射液，用量分別為0.2 mL（5 mg）、0.35 mL（8.75 mg）、0.5 mL（12.5 mg），模型組膝關節腔注射0.2 mL生理鹽水，每3 d干預1次，共干預10次，空白組不予處理。
　　1.4  組織形態學觀察
　　1.4.1  軟骨組織
　　 干預結束后，切取右膝內側脛骨平臺軟骨，15%中性甲醛溶液固定72 h后，EDTA脫鈣，石蠟包埋，進行番紅O染色。光學顯微鏡下對軟骨組織結構進行觀察，每張切片選擇3個不同的視野，參照Mankin’s關節軟骨病理評分標準[7]進行評分。
　　1.4.2  滑膜組織
　　 取右膝髕骨下滑膜組織，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，HE染色。每張切片選擇3個不同的視野，對滑膜里襯層細胞及滑膜下組織進行觀察并評分?；だ镆r層細胞觀察內容為增生、肥大和炎性細胞浸潤，滑膜下組織觀察內容為肉芽組織增生、血管組織長入和炎性細胞浸潤，均按無、輕、中、重分別計0、1、2、3分[8]。
　　1.5  關節液相關因子含量測定
　　 干預結束后，右膝關節腔生理鹽水沖洗法取關節液，ELISA測定關節液IL-6、IL-17、ADAMTS-4和ADAMTS-5含量，嚴格按試劑盒說明書進行操作。
　　1.6  統計學方法
　　 采用SPSS19.0統計軟件進行分析。實驗數據以±s表示，多組數據間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。
　　2  結果
　　2.1  軟骨組織形態學觀察及Mankin’s評分結果
　　 空白組軟骨表面平整光滑，軟骨結構層次清晰，著色均勻，軟骨細胞分布均勻;模型組軟骨坍塌，結構層次嚴重紊亂，細胞數顯著減少甚至消失，潮線模糊不清;青藤堿低劑量組軟骨表面粗糙不平整，軟骨自表層出現多處裂隙深達放射層，軟骨細胞明顯減少，潮線無法辨識;青藤堿中、高劑量組軟骨結構完整，表層粗糙不平整，軟骨細胞數彌漫性增多，潮線清晰完整。見圖1。與空白組比較，模型組Mankin’s評分顯著升高（P<0.01）;與模型組和青藤堿低劑量組比較，青藤堿中、高劑量組Mankin’s評分明顯降低（P<0.05，P<0.01）。見表1。
　　2.2  滑膜組織形態學觀察及評分結果
　　空白組滑膜薄而細胞數少，無炎性細胞浸潤;模型組滑膜里襯層顯著增厚，全層均有炎性細胞浸潤，滑膜下層有肉芽組織生成，伴血管增生;青藤堿低劑量組滑膜里襯層增厚，滑膜細胞肥大，炎性細胞浸潤明顯;青藤堿中、高劑量組里襯層少許炎性細胞浸潤。見圖2。與空白組比較，模型組滑膜評分顯著升高（P<0.01）;與模型組和青藤堿低劑量組比較，青藤堿中、高劑量組滑膜評分顯著降低（P<0.01），2組評分無顯著差異（P>0.05）。見表2。
　　2.3  青藤堿對模型兔關節液相關因子含量的影響
　　 與空白組比較，模型組兔關節液IL-6、IL-17、ADAMTS-4和ADAMTS-5含量顯著升高（P<0.01）;與模型組和青藤堿低劑量組比較，青藤堿中、高劑量組兔關節液IL-6、IL-17、ADAMTS-4和ADAMTS-5含量顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見表3。
　　3  討論
　　 OA是與增齡、肥胖、機械壓力和損傷等多種因素相關的復雜性關節疾病，其具體發病機制仍不明確。目前普遍認為，關節軟骨微環境變化導致的軟骨細胞合成代謝與分解代謝的不平衡是造成軟骨退變的核心問題，軟骨細胞分解代謝超過合成代謝，導致構成細胞外基質膠原的破壞和蛋白聚糖的流失[9]。近年來滑膜炎性反應在OA病理生理中作用日益受到關注，并被認為與力學因素發揮著同等重要的作用[10]。炎性環境下，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-6、IL-17等促炎細胞因子含量顯著提高，這些炎性細胞因子進而促進基質金屬蛋白酶（MMPs）和ADAMTS含量及活性顯著上調，導致軟骨細胞外基質分解代謝超過合成代謝[11]。IL-17作為促炎細胞因子，在自身免疫性疾病發病中發揮著重要作用。有研究發現，IL-17在類風濕關節炎患者滑膜中呈高表達[12]，IL-17能促進軟骨細胞、滑膜細胞、巨噬細胞和骨細胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性細胞因子，還可促進MMPs的合成，提高破骨細胞活性，抑制成骨細胞活性[13-15]。近年研究表明，IL-17在OA病理中也發揮著重要作用。OA患者關節液IL-17顯著升高，且IL-17水平與膝關節疼痛嚴重程度呈正相關，阻斷IL-17信號通路可以緩解關節疼痛[13]。MMPs和ADAMTS是在成年軟骨中參與軟骨細胞外基質降解的主要蛋白酶，OA病理生理中，MMPs主要參與膠原的降解，而ADAMTS則與聚集蛋白聚糖的流失密切相關，其中尤以ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達量和分解效率最高[16]。 　　 青風藤為防己科植物青藤及毛青藤的干燥藤莖，具有通絡、止痛、祛風濕之功效，主治風濕及類風濕關節炎、關節腫大、肢體疼痛、麻木等[17]?，F代藥理研究表明，青藤堿是青風藤中主要活性生物堿，具有祛風鎮痛、消炎、免疫抑制、降壓及抗心律失常等作用[17]。課題組前期研究表明，青藤堿可抑制木瓜蛋白酶誘導的膝OA模型兔滑膜炎性反應，降低關節液中MMP-13的含量，對軟骨具有保護作用[5]。本實驗病理學觀察顯示，中、高劑量青藤堿干預后，軟骨Mankin’s評分及滑膜評分均明顯降低;ELISA檢測發現，中、高劑量青藤堿可明顯降低關節液IL-6、IL-7、ADAMTS-4和ADAMTS-5含量，而低劑量青藤堿上述作用并不明顯，表明青藤堿抑制膝OA滑膜炎和保護關節軟骨的作用與劑量密切相關，其中以中、高劑量青藤堿作用更顯著。
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