鴉膽子苦醇對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響

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　　 摘要：目的  觀察鴉膽子苦醇（BRU）對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響，探討其作用機制。方法  用BRU處理MCF-7細胞。采用CCK-8法和流式細胞術檢測MCF-7細胞抑制率和凋亡率，Western blot檢測線粒體凋亡通路和內質網應激（ERS）相關蛋白的表達，利用免疫熒光技術實現Nrf2和p53蛋白定位。結果  與對照組比較，BRU顯著抑制MCF-7細胞增殖，110 nmol/L BRU誘導MCF-7細胞凋亡有時間依賴性。110 nmol/L BRU顯著降低Nrf2及下游蛋白表達，顯著增加GRP78、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Apaf-1、Bax/Bcl-2、Cytochrome C、Cleaved-caspase3、p53和p21蛋白的表達（P<0.05，P<0.01，P<0.001），細胞核Nrf2蛋白含量減少、p53蛋白含量增加。結論  BRU通過誘發ERS，抑制Nrf2蛋白表達和核轉移，破壞抗氧化作用，誘導MCF-7細胞凋亡。
　　關鍵詞：鴉膽子苦醇;人乳腺癌MCF-7 細胞;內質網應激;細胞凋亡
　　中圖分類號：R285.5    文獻標識碼：A    文章編號：1005-5304（2019）05-0044-05
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.010 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：
　　Abstract： Objective To investigate the effects of brusatol （BRU） on apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells; To discuss its mechanism of action. Methods MCF-7 cells were treated with BRU. The inhibitory ratio and apoptotic ratio of MCF-7 cells was detected by CCK-8 assay and flow cytometry， respectively. Western blot was used to detect the expression of mitochondrial apoptosis pathway and endoplasmic reticulum stress （ERS）-related protein， and Nff2 and p53 protein localization were achieved by immunofluorescence technique. Results Compared with the control group， BRU could significantly inhibit the proliferation of MCF-7 cells， and 110 nmol/L BRU induced MCF-7 cells apoptosis in a time-dependent manner. 110 nmol/L BRU significantly decreased the expression of Nrf2 and downstream proteins， and significantly increased expression of GRP78， p-PERK/PERK， p-eIF2α/eIF2α， ATF4， CHOP， Apaf-1， Bax/Bcl-2， Cytochrome C， Cleaved-caspase3， p53 and p21 proteins （P<0.05， P<0.01， P<0.001）. The content of Nrf2 protein decreased and the content of p53 protein increased. Conclusion Through inducing ERS， BRU inhibits Nrf2 protein expression and nuclear transfer， destroys antioxidant activity， and induces apoptosis in MCF-7 cells.
　　Keywords： brusatol; human breast cancer MCF-7 cell; endoplasmic reticulum stress; apoptosis
　　乳腺癌發病率已上升至女性惡性腫瘤第1位，成為婦女健康的最大威脅[1]。目前，臨床上大多采用放療和化療來延長乳腺癌患者的生存期、緩解癥狀，但治療有效率較低，毒副反應大。臨床上，癌細胞抗藥是目前癌癥藥物治療難以解決的棘手問題，主要原因之一是核轉錄因子2（Nrf2）發揮的細胞保護作用。已有研究顯示，腫瘤Nrf2異常激活，與癌癥藥物治療和輻射抗性有關[2]。近年來，一種源于苦木科植物鴉膽子種子喹諾酮——鴉膽子苦醇（brusatol，BRU）引起研究人員的關注。有實驗表明，BRU能通過抑制Nrf2表達，抑制多種癌細胞增殖，是潛在的天然抗腫瘤藥物[3]。但BRU具體通過何種途徑抑制Nrf2表達，至今尚未闡明。一些天然產物可誘發腫瘤細胞的內質網應激（ERS），進而促進腫瘤細胞凋亡[4]，這為闡明BRU的作用機制提供了契機。ERS對維持細胞正常穩態起重要作用，細胞發生嚴重的ERS，誘導細胞凋亡[5]。因此，本實驗從BRU可能誘發人乳腺癌細胞ERS這一推斷出發，將ERS與Nrf2鏈接起來，探討BRU通過誘發ERS激活p53，達到抑制Nrf2表達的作用，為人乳腺癌的藥物治療提供依據。 　　1  材料和方法
　　1.1  藥物
　　BRU，美國Sigma公司，使用時用二甲基亞砜（DMSO）溶解，并使BRU的終濃度低于0.01 g/L。
　　1.2  主要試劑與儀器
　　CCK-8檢測細胞增殖試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒和DAPI，美國BD;Apaf-1、Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Cleaved-caspase 3、Nrf2、HO-1、NQO-1、p53、MDM2、p21、PERK、p-PERK、GRP78、ATF4、eIF2α、p-eIF2α、CHOP及β-actin單克隆抗體，美國Abcam公司;辣根過氧化酶標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗和FITC標記的熒光二抗，北京博奧森公司;RPM 1640培養基和胎牛血清，北京全式金生物技術有限公司。雙人單面凈化工作臺（上海博訊實業有限公司），流式細胞儀（德國默克密理博公司），凝膠成像系統（美國Protein Sample），酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司），電泳儀、電泳槽（美國Bio-Rad），激光共聚焦顯微鏡（德國Zessi）。
　　1.3  細胞培養
　　人乳腺癌MCF-7 細胞，購自美國模式培養物保藏所。細胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，置于37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養。
　　1.4  細胞增殖抑制實驗
　　取對數生長期MCF-7細胞，調整細胞密度為1.5×104個/孔，接種于96孔板。培養24 h后，加經培養液稀釋的20、40、60、80、100 nmol/L BRU，繼續培養12、24、48 h，收樣。每組設3個復孔，分別加10 μL CCK-8，繼續培養2 h。于波長450 nm處測定各孔吸光度（A），計算抑制率[（A對照-A給藥）÷（A對照-A空白）×100%]。用GraphPad Prism5軟件繪制增殖抑制率曲線。
　　1.5  細胞凋亡分析
　　根據細胞增殖抑制實驗得出BRU的IC50，MCF-7細胞生長密度達70%時，加入IC50 BRU，培養12、24、48 h后收集細胞，棄細胞培養液，用預冷的PBS清洗3次，經0.25%胰酶消化1 min，用PBS懸浮細胞，調整細胞密度至5×104個/mL。按Annexin V- FITC/PI凋亡試劑盒說明書操作，流式細胞儀分析細胞凋亡率，計數1000個細胞，IDEAS軟件分析實驗數據，每組至少重復3次。
　　1.6  蛋白表達測定
　　MCF-7細胞生長密度達70%時，用10 ?mol/L阿霉素（Dox）處理細胞24 h，作為陽性對照。用IC50/2、IC50和2×IC50 BRU處理MCF-7細胞24 h，棄細胞培養液，用預冷的PBS清洗3次，加入100 μL蛋白裂解液，冰浴裂解20 min，經12 000×g離心10 min，收集上清液。經Bradford法定量后，用12%SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質，經轉膜、封閉、一抗4 ℃過夜和二抗孵育，化學發光法顯色，Protein Sample凝膠成像系統拍照記錄，并用系統自帶軟件分析灰度值。
　　1.7  蛋白免疫熒光定位
　　將多聚賴氨酸處理過的蓋玻片置于6孔板，調整MCF-7 細胞密度至5×104個/mL，接種細胞，當細胞生長密度達到70%左右時，用IC50的BRU處理MCF-7 細胞24 h，棄細胞培養液，用預冷的PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定，經室溫干燥。用0.2%Triton X-100透化細胞10 min，PBS清洗3次，用5%BSA封閉細胞30 min，經一抗4 ℃過夜和熒光二抗孵育。用終濃度為0.5 ?g/mL的DAPI染色10 min，PBS清洗3次，將蓋玻片置于載玻片，封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。
　　1.8  統計學方法
　　采用SPSS19.0統計軟件進行分析。實驗數據以±s表示。符合正態分布，組間比較用方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Tamhane'T2法;不符合正態分布，采用非參數統計中多個獨立樣本Kruskal- Wallis H檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。
　　2  結果
　　2.1  鴉膽子苦醇對MCF-7細胞增殖、凋亡的影響
　　BRU對MCF-7細胞增殖的抑制作用具有時間和劑量依賴性。20～100 nmol/L BRU對MCF-7細胞生長有不同程度的抑制作用，在12、24、48 h的IC50值分別為157.2、109.5、108.2 nmol/L（見圖1）。24、48 h 的IC50接近，這表明110 nmol/L BRU可顯著抑制MCF-7細胞增殖。因此，選用該濃度作為后續實驗的濃度。流式細胞術結果顯示，110 nmol/L BRU作用MCF-7細胞12、24、48 h后，細胞凋亡率顯著增加，表明BRU可時間依賴性地誘導MCF-7細胞發生凋亡（見圖2），24 h細胞凋亡率已顯著增加。因此，選取24 h作為后續實驗的時間點。
　　2.2  鴉膽子苦醇對MCF-7細胞核轉錄因子2及下游蛋白表達的影響
　　Western blot檢測結果顯示，BRU可降低Nrf2及下游蛋白的表達，見圖3。細胞核Nrf2含量減少，見圖4（紅色熒光代表Nrf2蛋白，藍色熒光代表細胞核）。提示BRU對MCF-7細胞Nrf2表達有抑制作用，BRU可破壞MCF-7細胞抗氧化，誘導細胞凋亡。
　　2.3  鴉膽子苦醇對MCF-7細胞內質網應激的影響
　　選取ERS標志蛋白GRP78和PERK/eIF2α/ATF4/ CHOP信號通路評判MCF-7細胞ERS狀況。Western blot結果顯示，BRU可增加GRP78、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4和CHOP表達，見圖5。 　　2.4  鴉膽子苦醇對MCF-7細胞線粒體凋亡通路蛋白表達的影響
　　Western blot結果顯示，BRU可增加Bax/Bcl-2、Apaf-1、Cytochrome C和Cleaved-caspase 3表達，見圖6。
　　2.5  鴉膽子苦醇對MCF-7細胞p53和p21蛋白表達的影響
　　p53蛋白在細胞凋亡中起重要的調控作用，它可作為轉錄因子激活p21，阻滯細胞進程，引起凋亡。Western blot結果顯示，BRU可顯著增加p53、MDM2和p21的表達，見圖7。細胞核中p53陽性表達增加，見圖8（紅色熒光表示p53蛋白，綠色熒光表示細胞核）。
　　3  討論
　　近年來，從天然產物中篩選癌癥治療藥物成為癌癥預防和治療研究的熱點。臨床試驗表明，BRU可有效抑制乳腺癌、胃癌、前列腺癌和結腸癌細胞的增殖，是潛在的天然抗腫瘤藥物[6]。雖然BRU可通過抑制Nrf2表達促進腫瘤細胞凋亡，但具體的信號轉導途徑尚不十分清楚。內質網對維持細胞正常生理功能有重要作用[7]，ERS能促進內質網對蓄積在網腔內的錯誤折疊或未折疊蛋白質的處理，從而更好維持細胞的正常功能并使之存活。但是，發生持續嚴重的ERS可誘導細胞凋亡[8]。為探討BRU引起的ERS與Nrf2表達的關系，本研究對Nrf2、PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信號通路、p53表達和線粒體凋亡途徑進行分析，以期揭示BRU抑制Nrf2表達的內在機制。
　　本研究結果表明，BRU可顯著抑制MCF-7細胞生長。經110 nmol/L BRU處理MCF-7細胞24 h，流式細胞儀分析結果顯示，BRU明顯誘導MCF-7細胞發生凋亡。GRP78是位于內質網中的伴侶蛋白，當ERS發生時其表達顯著增加[9]，轉錄因子CHOP是ERS激活的細胞凋亡途徑的關鍵參與者[10]。本研究發現，GRP78和CHOP蛋白過表達，表明BRU激活了ERS凋亡途徑。ERS激活PERK，進而磷酸化eIF2α，抑制mRNA翻譯成蛋白質，磷酸化的eIF2α也能激活ATF4表達，并導致CHOP表達升高[11]。BRU促進p-PERK、p-eIF2α、ATF4和CHOP的表達上調，表明BRU通過PERK/eIF2a/ATF4/CHOP信號通路激活ERS，導致MCF-7細胞凋亡。
　　本研究表明，ERS在BRU誘導MCF-7細胞中起核心調控作用。一方面，BRU通過誘發ERS，激活PERK，活化的PERK磷酸化eIF2α，使信使RNA翻譯成蛋白質的功能被抑制，造成ATF4蛋白表達上調，ATF上調后能夠促進讀碼框移位蛋白（alternative reading frame protein，ARF）與MDM2結合，使MDM2與p53解離，抑制p53的泛素化降解，穩定和激活p53。p53被激活后，發生核轉移，與ARF的啟動子區域結合，抑制Nrf2下游抗氧化蛋白NQO1和HO-1表達，使細胞活性氧含量升高，進而抑制Nrf2活性，誘導MCF-7細胞凋亡[12];p53被激活后，促進p21的轉錄，增加p21蛋白的表達，使MCF-7細胞發生G1/S期阻滯，進一步誘導凋亡[13]。此外，BRU通過誘發ERS，激活線粒體凋亡途徑，ERS通過減弱bcl-2表達，激活CHOP并誘導MCF-7細胞凋亡[14];同時，ERS又能直接激活Caspase-3，加速MCF-7細胞凋亡[15]。
　　綜上所述，BRU抑制MCF-7細胞的Nrf2表達、誘導凋亡是通過誘發ERS完成，ERS在這一過程起核心調控作用，這為BRU抑制Nrf2表達的機制研究提供了依據。此外，與傳統抗癌藥物相比，較低劑量BRU可顯著促進MCF-7細胞凋亡，具有一定的劑量優勢。
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　　（收稿日期：2018-09-13）
　?。ㄐ藁厝掌冢?018-10-27;編輯：華強）
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