Stattic 影響急性髓系白血病細胞DNA損傷修復與凋亡

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　　【摘要】 目的探討STAT3抑制劑Stattic對急性髓系白血?。ˋMI） U937與HL60細胞株的增殖、凋亡及DNA損傷修復的影響。方法分別以不同濃度Stattic處理U937與HL60細胞24 h，以細胞增殖一毒性檢測試劑（ CCK8）法檢測白血病細胞的增殖活性;以流式細胞技術檢測白血病細胞凋亡、細胞周期、DNA損傷以及DNA損傷修復情況。結果U937與HL60的增殖活性隨著Stattic濃度的升高而減弱（P均<0.05）。1、2.5、5μM的Stattic均可誘導HL60細胞凋亡增加（P< 0.001）;而U937僅在2.5、5μM濃度的Stattic處理后細胞凋亡才增加（P< 0.001），2種AML細胞凋亡比率均隨著Stattic藥物濃度增大而增加。2.5、5μM濃度的Stattic可將U937細胞周期阻滯在G2/M期（P<0.05），同時CO/GI期百分比下降（P<0.01）。1、2.5μM濃度的Stattic將HL60細胞周期阻滯在S期，同時G2/M期及Gl/CO期百分比下降（P<0.05），HL60細胞在Stattic 5μM時，SubGI百分比升高。經依托泊苷誘導DNA雙鏈斷裂后6h，Stattic處理后的U937與HL60細胞中γ-H2AX熒光強度仍維持在較高水平（P均<0.001）。結論Stattic可能通過誘導白血病細胞發生DNA損傷并阻礙其修復進而促進細胞凋亡。
　　【關鍵詞】 DNA損傷修復;STAT3抑制劑;急性髓系白血病;凋亡
　　急性髓系白血?。?AMI）是起源于造血干/祖細胞的惡性克隆性疾病。目前化學治療聯合造血干細胞移植仍然是大部分AML患者的標準治療方案。然而僅40% - 70%的患者可通過化學治療獲得完全緩解。部分患者對化學治療藥物發生耐藥[1]。對AML發病機制的研究促進了各類靶向藥物的開發與使用。PML/RARA融合基因陽性急性早幼粒細胞白血病患者經全反式維甲酸聯合砷劑治療基本可以達到臨床治愈[2]。而酪氨酸激酶3（ FLT3）抑制劑對FLT3-ITD突變AML患者療效卻不理想，表現為緩解期短[1]。部分靶向藥物療效持續時間短或與腫瘤細胞耐藥相關。AML發生耐藥的相關機制仍需要深入研究，以尋找新的靶向藥物。
　　轉錄激活因子3（ STAT3）是重要的信號轉導調節因子，磷酸化后呈活化狀態[3]。在大部分腫瘤中STAT3呈持續活化狀態[4-6]。抑制STAT3活性可促進腫瘤細胞凋亡[7-8]。研究顯示STAT3與DNA損傷修復（ DDR）相關[9-11]。細胞發生基因損傷后即啟動DDR。若損傷持續存在，則細胞發生凋亡[12]。許多腫瘤對放射治療及化學治療耐藥與腫瘤細胞DDR功能活躍有關。在大多數實體腫瘤中，抑制STAT3活性可增加DDR從而促進腫瘤細胞凋亡[10]。筆者目前尚未見STAT3抑制劑干擾白血病患者腫瘤細胞DDR的相關報道，故擬探討STAT3抑制劑對AML細胞的增殖、凋亡和DDR的影響。
　　材料與方法
　　一、實驗材料
　　AML細胞株U937與HL60由中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院贈予。STAT3抑制劑Stattic購于CAYMAN CHEMICAL公司，依托泊苷購于Sigma公司，藥物均用二甲基亞砜（DMSO）溶解后于-20℃保存，使用時用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋為需要濃度。凋亡檢測試劑盒、周期檢測試劑盒購于南京凱基生物公司，γ-H2AX熒光標記抗體（抗體）購于Bio-Legend公司。采用BD公司C6和Calibur流式細胞儀及Berthold公司多功能酶標儀。
　　二、實驗方法
　　1.細胞培養
　　U937和HL60細胞株復蘇后，用RPMI1640細胞培養基+ 10%胎牛血清（美國Gibco公司）培養于5%二氧化碳、37℃細胞培養箱中，細胞密度維持在lx 105 -lx 106，2-3d更換培養基。
　　2.細胞活力檢測
　　收集對數生長期的U937與HL60細胞株，調整細胞密度約為1×105/ml;將對數生長期細胞接種于96孔板中，每孔100μl，藥物組分別予1、2.5、5、10μM的Stattic處理，陰性對照組予DMSO處理，空白對照為培養基，每組設置3個重復孔;將培養板置于5%二氧化碳、37℃的培養箱培養24 h;向每孔加入10μl的細胞增殖一毒性檢測試劑（ CCK8），將培養板在培養箱內孵育2h;用酶標儀測定在450 nm處的吸光度（OD）。增殖抑制率（%）=[1-（OD實驗-OD空自組）/（0D陰性對照一OD空自組）]×100%
　　3.AML細胞周期的檢測
　　采用不同濃度Stattic處理對數生長期U937與HL60細胞株24 h后收集各細胞樣品，用PBS洗3次后去上清，加入500 μl 70%預冷乙醇固定2h，用PBS洗去固定液，加入500 μl PI/RNase A染色液（ PI：Rnase A=9：1），室溫避光30 - 60 min，于Calibur流式細胞儀上檢測，用Flowjo-VIO處理圖像。
　　4.細胞凋亡的檢測
　　采用不同濃度Stattic處理對數生長期U937與HL60細胞株24 h后收集各細胞樣品，用預冷PBS（含2%胎牛血清）洗滌3次后用Bingdingbufferl00μl重懸，加5μl Annexin V-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光15 min。在BD公司C6流式細胞儀上測熒光強度，調節熒光補償，用Flowjo-V10處理圖像。
　　5.細胞DDR的相關檢測
　　細胞DDR速度的檢測：采用終濃度為6μg/ml的依托泊苷處理對數生長期U937與HL60細胞株，在細胞培養箱中培養2.5 h誘導DNA雙鏈斷裂。洗脫藥物后加入新鮮培養基繼續培養，分別培養0、2、4、6h后，收集各時間點細胞樣品，用PBS洗滌3次后去上清，室溫避光下用4%多聚甲醛重懸，靜置15 min，用PBS洗去4%多聚甲醛后加入預冷的70%乙醇，將流式管放置于渦旋振蕩器上，振蕩混勻，-20℃下孵育60 min。用PBS洗去乙醇后重懸，加入5 μlγ -H2AX抗體，避光室溫孵育90 min。Calibur流式細胞儀上檢測熒光強度。Flowjo-V10處理圖像并計算平均熒光強度（MFI）。 　　Stattic對細胞DNA雙鏈斷裂的影響：采用不同濃度Stattic處理對數生長期U937與HL60細胞株24 h后收集各細胞樣品，用PBS洗滌，離心后用前述方法孵育γ-H2AX抗體，在Calibur流式細胞儀上測熒光強度，用Flowjo-V10處理圖像并計算MFI。
　　Stattic對細胞DDR的影響：采用終濃度為6μg/ml的依托泊苷處理對數生長期U937與HL60細胞株，在細胞培養箱中培養2.5 h誘導DNA雙鏈斷裂。洗脫藥物后，將各細胞株分為對照組與實驗組，分別在含DMSO及2.5 μM Stattic的新鮮培養基中繼續培養，6h后收集各細胞樣品，離心后用前述方法孵育的γ-H2AX抗體在Calibur流式細胞儀上測熒光強度，Flowjo-VIO處理圖像并計算MFI。
　　三、統計學處理
　　圖像均采用Adobe Illustrator和GraphPad Prism處理，所有數據采用SPSS 19.0分析。符合正態分布的計量資料以x±s表示，2組均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
　　結果
　　一、Stattic抑制AML細胞增殖
　　CCK8檢測顯示，U937與HL60的增殖活性隨著Stattic濃度的升高而減弱（P均<0.001），見表1。
　　二、Stattic促進AML細胞凋亡
　　1、2.5、5μM的Stattic均可誘導HL60細胞凋亡增加（P<0.001）;而U937僅在2.5、5μM濃度的Stattic處理后細胞凋亡才增加（P<0.001），n=3，見圖1。2種AML細胞凋亡比率均隨著Stattic藥物濃度增大而增加。
　　三、Stattic阻滯AML細胞周期
　　各周期不同Stattic濃度組間比較中，U937：FSubGl=176.327， FG0/G1= 67.602， Fs= 43.302， FG2/M= 70.174; HL60： FSubGl=902.326， FG0/G1= 254.493，Fs= 470.447， FG2/M= 35.438.P均<0.001）。 2.5、5μM濃度的Stattic可將U937細胞周期阻滯在G2廠期（P<0.05），同時GO/G1期百分比下降（P<0.01）。l、2.5μM濃度的Stattic將HL60細胞周期阻滯在S期，同時G2/M期及G1/GO期百分比下降（P<0.05），HL60細胞在Stattic 5μM時，SubG1百分比升高，提示細胞凋亡較多。n=3，見圖2。
　　四、AML細胞具有DNA雙鏈斷裂損傷修復能力
　　依托泊苷誘導U937與HL60細胞雙鏈斷裂后，U937與HL60γ-H2AX平均熒光水平均高于空白對照組，明確發生了DNA雙鏈斷裂。在隨后的2、4、6h后，U937與HL60中的DNA雙鏈斷裂損傷得到了修復，表現為γ-H2AX熒光水平逐漸下降。n=3，見圖3。
　　五、Stattic誘導AML細胞DNA雙鏈斷裂并阻礙其修復
　　HL60經不同濃度Stattic處理后均發生了DNA雙鏈斷裂，其程度隨著藥物濃度的增加而增大（F= 38.367.P<0.001）0 U937經2.5、5μM Stattic處理后也發生了DNA雙鏈斷裂（F=399.164，P< 0.001），但經1μM Stattic處理后也出現DNA雙鏈斷裂，但無前2組明顯。經依托泊苷誘導DNA雙鏈斷裂后6h，Stattic處理后的U937與HL60細胞中γ-H2AX熒光強度仍維持在較高水平，提示Stattic阻礙了DNA雙鏈斷裂修復（t u937=199.7，P< 0.001;tHL60= 29.11，P<0.001）。以上實驗結果均提示Stattic可以誘導AML細胞發生DNA雙鏈斷裂并阻礙其修復。
　　討 論
　　1995年Yu等首次發現STAT3與腫瘤的發生與進展相關，目前，越來越多的研究證實了這個觀點，70%的實體瘤和血液腫瘤具有STAT3活性增強的特性[13]。STAT3可以通過AKT/STAT3、Ras/Raf/MAPK、PI3K/AKT/mTOR通路促進白血病細胞增殖，同時，STAT3通路異?；罨€會導致凋亡相關蛋白表達失衡[7，13]。
　　STAT3在白血病細胞的增殖中發揮重要作用[14]。Stattic屬于非肽類STAT3小分子抑制劑，特異性地抑制STAT3 SH2結構域的功能，對STAT5、STATI幾乎沒有抑制作用，是STAT3抑制劑中特異性較好的小分子抑制劑。在本次實驗中我們發現，經Stattic作用24 h后，AML細胞HL60及U937的細胞周期阻滯在S、G2/M期，抑制增殖，這與目前報道的抑制STAT3活性可以有效地抑制急性淋巴細胞白血病細胞增殖相符[13]。
　　STAT3的持續活化可抑制白血病細胞的凋亡，有研究者在FLT3-ITD突變的細胞株MV4-11中發現，p-STAT3的高表達導致抗凋亡基因Survivin表達上調，抑制細胞凋亡。在慢性淋巴細胞白血病細胞中，STAT3活化可上調抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL、Cyclin D1和ROR1表達，抑制細胞凋亡[7]。抑制STAT3的活性可調節凋亡相關蛋白的表達，促進白血病細胞的凋亡。在本實驗中，Stattic能誘導AML細胞U937和HL60細胞凋亡，隨著藥物濃度增加，凋亡百分比增加。有研究顯示，在HL60細胞中抑制STAT3活性可以上調促凋亡蛋白Caspase-3、P27和P21，同時降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達促進細胞凋亡[7]。然而，STAT3抑制劑對DDR的影響是否參與了白血病細胞的凋亡，目前尚無相關報道。 　　本實驗顯示AML細胞株U937和HL60在依托泊苷誘導DNA雙鏈斷裂后可對受損的DNA進行修復，而在加用Stattic后，DDR速度下降，這提示其可阻礙DDR，從而增加U937和HL60細胞對依托泊苷誘導DNA雙鏈斷裂的敏感性。Stattic單藥作用24 h后可誘導U937和HL60細胞發生DNA雙鏈斷裂，并且DNA雙鏈斷裂水平也隨著藥物濃度升高而升高。所以Stattic可通過誘導DNA雙鏈斷裂并阻礙細胞對DNA雙鏈斷裂的修復，從而促進白血病細胞凋亡，增加白血病細胞對化學治療藥物依托泊苷的敏感性。許多傳統化學治療藥物均通過誘導DNA損傷，最終誘導白血病細胞的凋亡。然而誘導DNA損傷的化學治療藥物也會激活DDR反應，且大部分腫瘤細胞具有較高的DNA修復能力，這是腫瘤細胞對化學治療耐藥的主要機制之一[15]。在A549人肺癌細胞株CD133+的腫瘤干細胞中DDR相關的基因表達上調，較強的DDR能力是肺癌干細胞難以清除的原因[16]。因此，阻礙DDR速度是目前突破化學治療耐藥的重要途徑之一。在非小細胞肺癌中，奧斯替尼可降低肺癌細胞DDR速度，從而增加放射治療或致DNA損傷化學治療藥物的敏感性，減低腫瘤細胞耐藥率[17]。在白血病細胞中，西達本胺能夠下調DNA修復相關基因，維持γ-H2AX水平以及增加細胞對蒽環類化學治療藥物的敏感性[18]。STAT3與DNA損傷修復密切相關，在敲除STAT3基因的小鼠胰腺B細胞中DNA損傷增加[9]。在食管癌及膠質母細胞瘤中均發現抑制STAT3活性可抑制DNA損傷修復，提高腫瘤對放射治療及化學治療的敏感性[10-11]。本實驗也證實了在AML細胞中，STAT3抑制劑可阻礙DDR。
　　本實驗初步證實Stattic可抑制AML細胞株U937和HL60的增殖，促進其凋亡。阻滯細胞周期于S、G2/M期及誘發DNA雙鏈斷裂、阻礙DDR是抑制增殖、促進凋亡的可能機制。Stattic通過影響哪些DNA修復通路抑制DDR需要進一步研究證明。
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