甘肅省隴東南大豆孢囊線蟲的發生和分布

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　　摘要 為了解甘肅省隴東南地區大豆孢囊線蟲病分布和發生程度，采用Z字形取樣法，對甘肅省隴東南地區9個縣（區）37個鄉鎮大豆孢囊線蟲病的發生和分布進行調查，并根據形態特征和rDNAITS序列比對鑒定線蟲種類。共采集土樣411份，隴東地區大豆孢囊線蟲檢出率為87.2%，其中鎮原、西峰、正寧、華池和環縣的檢出率最高，達100%，鎮原孢囊發生量最大，平均孢囊數為11.4個/100 g土;隴南地區大豆孢囊線蟲檢出率為63.7%，成縣和徽縣分別為64.0%、63.0%，平均孢囊數分別為0.9和1.2個/100 g土。經形態學特征觀測和rDNAITS序列比對，甘肅省隴東南采集到的孢囊線蟲均鑒定為大豆孢囊線蟲Heterodera glycines。
　　關鍵詞 大豆孢囊線蟲病; 分布; 發生; 鑒定
　　中圖分類號： S 432.45
　　文獻標識碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018253
　　Abstract In order to understand the occurrence and distribution of soybean cyst nematode in southeast of Gansu Province， zigzag sampling method was used to investigate soybean cyst nematodes in 37 townships of 9 counties in southeastern Gansu. The species of nematodes were identified based on the morphological observation and rDNAITS sequence analysis. Totally， 411 samples of soil samples were collected. The results showed that the detection rate of soybean cyst nematodes in eastern Gansu was 87.2%， among which the detection rates in Zhenyuan， Xifeng， Zhengning， Huachi and Huan County were the highest， with the rates of 100%， while that in Qingcheng was the lowest by 39.3%. The highest density was found in Zhenyuan with the average cysts number of 11.4 per 100 g soil. The detection rate of soybean cyst nematodes in southern Gansu was 63.7% and those in Chengxian and Huixian were 64.0% and 63.0%， respectively， and average densities of nematodes were 0.9 and 1.2 per 100 g soil， respectively. Morphological observation and rDNAITS sequence analysis showed that the cyst nematodes collected in southeastern Gansu were identified as Heterodera glycines.
　　Key words soybean cyst nematode disease; distribution; occurrence; identification
　　大豆孢囊線蟲Heterodera glycines是豆類生產上的重要線蟲，在世界各主要大豆產區均有發生[1]。1899年俄國人雅切夫斯基等在我國黑龍江省西部首次發現大豆孢囊線蟲病，隨后巴西、日本、韓國、朝鮮、美國、加拿大、哥倫比亞、印度尼西亞、俄羅斯、埃及等國家相繼報道了大豆孢囊線蟲的發生[24]。目前，我國黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、北京、河南、河北、山東、山西、安徽、江蘇、湖北、浙江、上海、新疆、陜西、寧夏和甘肅等地已證實有大豆孢囊線蟲分布[58]。該病一般造成大豆減產5%～10%，嚴重時減產達30%～50%，甚至絕產[5，910]，嚴重制約豆類作物生產安全。
　　近年來，隨著大豆孢囊線蟲在各地嚴重發生，貴州、山東、河北、新疆及黑龍江等地對大豆孢囊線蟲開展了較系統的研究，但甘肅省相關研究的報道較少。葉文興等[11]，Peng等[12]報道在甘肅省發現大豆孢囊線蟲，但有關其發生情況和危害程度尚缺乏了解。
　　甘肅省種植大豆區域廣、歷史久，隴東南是甘肅省大豆主產區，以種植春播大豆為主，多數地區小麥、玉米、大豆進行輪作，少數夏播大豆是在小麥和油菜收獲后復種。目前，大豆孢囊線蟲在甘肅省的分布、發生以及危害情況尚不清楚，一旦大面積發生，將嚴重影響甘肅地區大豆的安全生產。本研究擬對甘肅隴東南地區大豆孢囊線蟲開展調查研究，以期明確大豆孢囊線蟲病在該地區的分布、發生程度，并對病原線蟲種類進行鑒定，為該病害的及時有效防治提供依據。
　　1.2 孢囊的分離和計數
　　參照李惠霞等[13]的試驗方法，隨機取100 g風干后土樣倒入塑料桶內，加入自來水攪拌使其泥漿均勻，靜置2～3 min，將上層的懸浮液依次倒入26目和60目的篩網過濾，重復3～4次。沖洗26目篩網上的殘留物，使孢囊和細渣全部沖入60目篩網中，用小水流從正面輕輕淋洗60目篩。沖洗干凈后，用洗氣瓶沖洗60目網篩上的剩余物質至尼龍紗上，編號，在解剖鏡下檢查尼龍紗上的孢囊并計數，統計孢囊檢出率。 　　孢囊檢出率=檢測出孢囊的土樣數/總土樣數×100%。
　　1.3 孢囊線蟲的形態學鑒定
　　從各群體中挑選飽滿孢囊，參照馮志新[14]的方法在體視顯微鏡下用鋒利的解剖刀切下陰門錐，用牙簽或者昆蟲針輕輕清除陰門錐內側附著物，轉移到40% H2O2中漂白處理4 min。依次轉移至70%、95%、100% 乙醇中脫水，制作成臨時玻片。參照王明祖等[15]的方法鑒定孢囊線蟲的種類。
　　1.4 孢囊線蟲DNA的提取
　　參照彭德良等[16]的方法提取線蟲DNA。挑取1個飽滿孢囊，放入裝有14 μL滅菌重蒸水的Eppendorf管中，加入3 μL10×PCR buffer（含Mg2+）和3 μL蛋白酶K，在液氮中速凍1 min。用乙醇消毒的玻璃棒快速研磨1～2 min。-20℃冷凍2 h，然后將Eppendorf管在65℃下溫育1.5 h，95℃處理10 min，使蛋白酶K變性，離心1 min，取上清DNA懸浮液放入-20℃保存，備用。
　　1.5 不同地區大豆孢囊線蟲群體的rDNAITS擴增及測序分析
　　采用25 μL的PCR擴增體系[17]：模板DNA 2 μL、通用引物TW81（5′GTTTCCGTAGGTGAACCTGC3′）和AB28（5′ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3′）各1 μL、10×PCR buffer（含Mg2+）2.5 μL、dNTPs 1 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O補足到25 μL。擴增條件：94℃預變性4 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，循環35次;72℃延伸10 min，擴增產物-20℃保存。取5 μL擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，100 V，30 min，電泳后在紫外燈下觀測、照相。將擴增產物送上海生工生物技術有限公司進行純化測序，進行親緣關系分析。
　　2 結果與分析
　　2.1 甘肅隴東南大豆孢囊線蟲的分布
　　本試驗采集了甘肅隴東南9個縣（區）37個鄉鎮的411份土壤樣品，調查結果表明，295份土壤樣品含有孢囊線蟲，孢囊檢出率為71.8%（表2）。所調查的9縣均有孢囊線蟲分布，其中鎮原、西峰、正寧、華池及環縣的檢出率最高，達100%。寧縣、徽縣、成縣的孢囊檢出率分別達到98.2%、63%、64%，檢出率最低的是慶城，為39.3%（表2）。
　　2.2 甘肅隴東南孢囊線蟲發生程度
　　由表3可知，甘肅隴東南調查的9個縣（區）均有大豆孢囊線蟲發生，不同地區大豆孢囊線蟲密度差別較大，同一地區大豆田的孢囊線蟲發生程度也存在差異。平均孢囊數為5.9個/100 g土。鎮原和寧縣孢囊線蟲發生程度最為嚴重，每100 g土樣平均孢囊數分別為11.4個和10.7個，個別地塊土樣孢囊數超過20個;隴南地區的成縣和徽縣孢囊線蟲發生程度最輕，每100 g土樣平均孢囊數分別為1.2個和0.9個，且35%以上的土樣無孢囊檢出，60%以上土樣每100 g土中平均孢囊數在1～5個之間（表3）。
　　2.3 孢囊線蟲的形態學鑒定
　　孢囊呈梨形或檸檬形，顏色淺褐色至深褐色（圖1a），長度為663.1 μm（547.0～752.1 μm）;寬度為457.5 μm（343.3～565.0 μm）;陰門錐下方有較多明顯的長形泡狀突，具有雙半膜孔，兩膜孔間有發育良好的下橋（圖1b），陰門膜孔長度41.4 μm（38.8～43.3 μm）;膜孔寬度40.3 μm（39.3～41.1 μm）;陰門裂長42.4 μm（36.3～47.8 μm）;下橋長89.3 μm（82.1～101.8 μm）。本試驗研究結果與劉維志等[6]的測量結果基本一致，將其初步鑒定為大豆孢囊線蟲H.glycines。
　　2.4 不同地區大豆孢囊線蟲群體rDNAITS序列分析
　　對甘肅省隴東南采集的孢囊線蟲群體的rDNAITS進行PCR擴增，均擴增出約1 000 bp的DNA片段（圖2）。選擇具有代表性群體在GenBank中進行同源性比對分析，結果表明采自隴東西坡（GsXp，MH371304）、玄馬（GsXm，MH371375）、洪得（GsHd，MH371378）、焦作（GsJz，MH375356）、肖金（GsXj，MH375357）、上肖（GsSx，MH375358）、隴南拋沙（GsPs，MH375376）的孢囊線蟲群體rDNAITS序列與來自美國的大豆孢囊線蟲群體（Clone3460）ITS序列（KY794755）相似度達99%;而隴東焦作、隴南拋沙兩個群體的rDNAITS序列與來自我國山東的大豆孢囊線蟲群體（YS1）ITS序列（JQ068764）、伊朗大豆孢囊線蟲群體（Did38）ITS序列（JX024210）相似性達100%。綜上，根據形態觀察和ITS序列分析，確定甘肅省隴東南地區寄生在大豆上的孢囊線蟲均為大豆孢囊線蟲H.glycines。
　　3 討論
　　大豆孢囊線蟲屬于孢囊線蟲屬Heterodera，是一種土傳的定居性內寄生線蟲，也是具有毀滅性危害的植物線蟲。大豆孢囊線蟲可在顯微鏡下通過觀察孢囊形態進行鑒別，成熟的孢囊為檸檬形或梨形，淺褐色至深褐色，頸部和尾部有明顯突出，陰門錐雙半膜孔，陰門裂較長，兩膜孔間的下橋明顯[18]。本試驗采集的孢囊線蟲經形態學鑒定和rDNAITS序列分析表明均是大豆孢囊線蟲，與葉文興等[12]的鑒定結果一致。
　　大豆孢囊線蟲可通過跨區作業的收割器械，水流及沙塵暴等傳播。甘肅與青海、陜西、寧夏和新疆四省相鄰，而新疆、陜西和寧夏均發現大豆孢囊線蟲病[19]。2003年，張俊立等[20]在河北省采集大豆根際土壤樣品65份，大豆孢囊線蟲檢出率高達73.93%。宋美靜等[21]對全國20個?。ㄗ灾螀^）的大豆孢囊線蟲進行調查，結果總檢出率達69.4%，其中東北和黃淮海地區發生率最高，滄州、長春和黑河地區檢出率高達100%。黑龍江省35個地區大豆孢囊線蟲的發生率高達100%，每年造成的損失高達數十億元[22]。龍海波等[23]對貴州省大豆孢囊線蟲的發生和危害進行調查，結果表明總檢出率僅為28.2%，但大方縣和赫章縣發生嚴重，檢出率超過40%。本試驗表明，甘肅省大豆主產地區大豆孢囊線蟲的發生較普遍，隴東地區大豆孢囊線蟲的檢出率為87.2%，隴南地區大豆孢囊線蟲的檢出率為63.7%。在本試驗中，慶陽地區大豆孢囊檢出率高于隴南，可能是由于隴南降雨量遠大于慶陽，而大豆孢囊最適宜孵化的土壤含水量為10%～25%[24]，土壤含水量過高會抑制孢囊線蟲的繁殖;隴南地區長期實施小麥、馬鈴薯、玉米和大豆輪作種植，也是導致大豆孢囊線蟲發生率低的原因。 　　大豆是甘肅隴東南地區主要經濟作物，目前甘肅省種植面積保持在13.33萬～15.33萬hm2，隴東地區面積最大，達到10萬hm2[25]。本研究表明，隴東地區檢出率為87.2%，由此可推算出僅隴東地區大豆孢囊線蟲病的發生面積約為8.7萬hm2。甘肅省地處黃土、青藏和蒙古三大高原交匯地帶，氣候類型多樣，且位于黃河上游，沙塵和黃河灌溉水加劇了大豆孢囊線蟲的傳播和蔓延。隴南地區氣候溫和，屬東亞季風氣候;隴東地區屬半干旱區，年均降水量500 mm，是典型大陸性氣候，適宜大豆孢囊線蟲病發生。
　　大豆孢囊線蟲病是一種積年流行病害，且病情逐年加重。在實際生產中種植抗耐病品種輪作、噴施化學藥劑及生物防治等措施均對大豆孢囊線蟲病有一定的防治作用[26]，但這些措施都存在局限性，輪作周期長，在有限的耕地資源內不易實現，生物防治在大田中不穩定，易受環境影響，常用殺線劑成本較高且污染環境，農戶難以接受。大豆孢囊線蟲理論上存在16個生理小種[27]，連續種植抗病品種會改變生理小種，導致育種的難度增加。因此，應進一步研究甘肅省大豆孢囊線蟲的侵染規律、生理小種類型，探明該病害防治關鍵期，通過田間試驗篩選出生防制劑和高效低毒的殺線劑，為今后甘肅省大豆孢囊線蟲的防治奠定基礎。
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