槐花飲片標準湯劑研究
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摘要：目的 制備槐花飲片標準湯劑，并建立質量控制方法。方法 制備15批槐花飲片標準湯劑，以總黃酮和蘆丁為檢測指標，計算出膏率、指標成分含量和轉移率，并建立超高液相色譜（UPLC）特征圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》軟件進行分析和相似度評價。結果 15批槐花飲片標準湯劑出膏率為28.7%～39.7%;總黃酮含量為158.07～210.55 mg/g，轉移率為49.46%～73.19%;蘆丁含量為105.26～127.35 mg/g，轉移率為41.30%～75.67%。15批槐花飲片標準湯劑UPLC特征圖譜標定了9個共有峰，并指認蘆丁1個色譜峰，通過與對照圖譜比對，相似度均高于0.99。結論 本研究建立了槐花飲片標準湯劑的質量評價方法，且準確、穩定、重復性良好，可為槐花配方顆粒的質量控制提供參考。
關鍵詞：槐花飲片;標準湯劑;配方顆粒;特征圖譜;蘆丁
中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2019）06-0086-06
Abstract： Objective To prepare standard decoction of Sophorae Flos decoction pieces; To establish the method of quality control. Methods Fifteen batches of standard decoction of Sophorae Flos decoction pieces were prepared. With total favonoids and rutin as the detection index， the extraction rate， content and transfer rate of index components were calculated and the UPLC characteristic chromatograms was established. Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012） was used to analyze and compare the characteristic chromatograms. Results The extractum rate of 15 batches of Sophorae Flos decoction pieces was at the range of 28.7%–39.7%; the content of total favonoids ranged from 158.07 mg/g to 210.55 mg/g and transfer rate ranged from 49.46% to 73.19%; the content of rutin ranged from 105.26 mg/g to 127.35 mg/g and transfer rate ranged from 41.30% to 75.67%. UPLC characteristic chromatograms of 15 batches of standard decoction marked nine common chrmatographic peaks and identified one chromatographic peak of rutin. The similarity was higher than 0.99 by comparison with the control map. Conclusion The quality control method of Sophorae Flos decoction pieces was established. The method is accurate， stable and with good repeatability， which can provide a reference for the quality control of formula granules of Sophorae Flos.
Keywords： Sophorae Flos decoction pieces; standard decoction; formula granules; characteristic chromatogram; rutin
蕾及花。槐花始載于《日華子諸家本草》：“治五痔，心痛，眼赤，殺腹臟蟲及熱，治皮膚風，及腸風瀉血，赤白痢?！薄夺t學啟源》謂其“涼大腸熱”，《本草綱目》載：“炒香頻嚼，治失音及喉痹，又療吐血、衄、崩中漏下。”槐花性微寒，味苦，歸肝、大腸經，具有涼血止血、清肝瀉火功效，用于治療便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝熱目赤、頭痛眩暈[1-2]。槐花的化學成分主要包括黃酮及皂苷類，其中黃酮類是主要藥效成分，以蘆丁含量較高[3-4]。藥理學研究表明，槐花水浸劑能顯著縮短出血和凝血時間，制炭后其凝血作用增強，煎液具有減少心肌耗氧量、保護心功能的作用;其主要成分蘆丁對大腸埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌、水皰性口炎病毒有明顯抑制作用，還能降低毛細血管的異常通透性、脆性，可用于高血壓、腦溢血、出血的治療和預防，能維持血管抵抗力等，還可使蟾蜍下肢及兔耳血管收縮[5-7]。
隨著社會的發展，配方顆粒及破壁飲片等多種中藥飲片應用形式應運而生并廣泛應用于臨床，同時也存在質量標準不明確和劑量不統一等問題。原國家食品藥品監督管理總局為了規范配方顆粒的管理，起草了《中藥配方顆粒管理辦法（征求意見稿）》[8]，國家藥典委員會隨后發布了《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求（征求意見稿）》[9]，并提出標準湯劑一詞，規定中藥配方顆粒的所有藥學研究均應與標準湯劑進行比對，保證兩者質量一致性。標準湯劑的制備遵循傳統湯劑的煎煮原則，對工藝流程要求規范化和標準化，保證臨床用藥的準確性[10]。中藥飲片標準湯劑失去了原有的飲片形態，僅靠指標成分的定性和定量測定難以保證其質量，以特征圖譜為主的整體質量控制方法越來越受到重視。本研究采用15批槐花飲片制備標準湯劑，考察總黃酮和蘆丁的含量、轉移率及出膏率的范圍，建立槐花標準湯劑超高液相色譜（UPLC）特征圖譜，為槐花配方顆粒及源于槐花水煎液的制劑質量控制提供參考。 1 儀器與試藥
島津高效液相色譜儀，包括LC-15C泵、SPD-15C型紫外檢測器、SIL-10AF自動進樣器、CTO-15C柱溫箱、島津LC色譜工作站;超高效液相色譜儀Waters UPLC H-Class，Empower色譜工作站;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;TB-215D、BSA224S-CW電子分析天平，北京賽多利斯;JY10001型電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司;KQ-250型超聲波清洗器（功率250 W，頻率40 kHz），昆山市超聲儀器有限公司;RE-3000型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠;FD-1C-50型冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司;BJH-W200F型陶瓷自動中藥煲（電源220 V、50 Hz，功率300 W，容量3.0 L），廣東天際電器股份有限公司。
蘆?。ㄅ?00080-201610），中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純（Fisher，USA），水為超純水和純化水，其他試劑均為分析純。15批槐花飲片來源見表1，神威藥業集團有限公司提供，經河北省藥品檢驗研究院孫寶惠主任藥師鑒定為豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花蕾及花。
2 方法與結果
2.1 槐花飲片的檢測
按2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）槐花飲片項下規定進行檢測。15批槐花飲片的含水量為8.66%～10.20%，總灰分為8.60%～13.80%，酸不溶性灰分為2.1%～6.1%，浸出物為37.5%～52.1%，總黃酮含量為8.5%～12.5%，蘆丁含量為6.7%～10.9%，均符合規定。
2.2 標準湯劑的制備
稱取槐花飲片100.0 g，煎煮2次，一煎加水12倍，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸30 min，趁熱用200目篩網分離煎液，二煎加水10倍，武火煮沸，文火保持微沸20 min，趁熱用200目篩網分離煎液，合并2次煎液，迅速冷卻，60 ℃真空減壓濃縮至密度約為1.02～1.05時，測定pH值和密度，放入冰柜（-40 ℃）冷凍過夜，然后冷凍干燥，得干膏粉，以干膏粉計算出膏率。
2.3 標準湯劑定量測定
2.3.1 蘆丁含量測定
2.3.1.1 色譜條件與系統適用性
采用島津Wondasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動相為甲醇-1%冰醋酸（32∶68），流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測波長為257 nm，進樣量為5 ?L，理論板數按蘆丁峰計算應不低于2000。
2.3.1.2 對照品溶液的制備
精密稱取蘆丁對照品5.38 mg，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得對照品母液。精密量取母液1 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得濃度為0.105 4 mg/mL的對照品溶液。精密量取對照品溶液2.5 mL至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.052 7 mg/mL的對照品溶液。
2.3.1.3 供試品溶液的制備
精密稱取槐花飲片標準湯劑干膏粉約0.05 g，置100 mL量瓶中，加甲醇95 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）10 min，取出，放冷，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾，即得。
2.3.1.4 測定法
精密吸取上述對照品溶液和供試品溶液各5 ?L，注入液相色譜儀，測定，色譜圖見圖1。
2.3.2 總黃酮含量測定
2.3.2.1 對照品溶液的制備
取蘆丁對照品51.14 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得對照品貯備液。精密量取對照品貯備液2.5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.3.2.2 標準曲線的制備
精密量取上述對照品溶液2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應的試劑為空白，按2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則0401紫外-可見分光光度法，在500 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。
2.3.2.3 測定法
取本品粉末約0.05 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇45 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）10 min，取出，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，按“2.3.2.2”項下方法，自“加水至6 mL”起，依法測定吸光度，按標準曲線計算供試品溶液中總黃酮的含量。
2.3.3 樣品測定
按上述方法對15批槐花飲片標準湯劑進行測定。結果15批標準湯劑出膏率為28.7%～39.7%，平均34.31%;蘆丁含量為105.26～127.35 mg/g，平均116.68 mg/g，轉移率為41.30%～75.67%，平均51.23%;總黃酮含量為158.07～210.55 mg/g，平均184.14 mg/g，轉移率為49.46%～73.19%，平均61.19%。見表2。
2.4 特征圖譜分析 2.4.1 色譜條件
采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m），流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫條件見表3，檢測波長為257 nm，流速為0.3 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量為1 ?L。
2.4.2 對照品溶液的制備
精密稱取蘆丁對照品5.38 mg，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得對照品母液。精密量取母液1 mL至10 mL容量瓶，加甲醇稀釋至刻度，即得濃度為0.105 4 mg/mL的對照品溶液。精密量取對照品溶液2.5 mL至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.052 7 mg/mL的對照品溶液。
2.4.3 供試品溶液的制備
精密稱取槐花飲片標準湯劑干膏粉約0.05 g，置100 mL量瓶中，加甲醇95 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）10 min，取出，放冷，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾，即得。
2.4.4 特征圖譜的建立及相似度評價
精密稱取15批槐花飲片標準湯劑約0.05 g，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。將15批槐花飲片標準湯劑的色譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》軟件，通過多點校正將色譜峰自動匹配，生成對照圖譜，標定了9個共有峰，并指認蘆丁1個色譜峰，因蘆丁色譜峰的峰形好、較高且穩定，故選擇為參照峰。結果見圖2、圖3。
采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》軟件對15批槐花飲片標準湯劑特征圖譜進行相似度評價，結果S1～S15特征圖譜與共有模式對照指紋圖譜相似度分別為1.000、1.000、0.999、0.999、0.999、1.000、0.999、0.998、0.999、1.000、0.996、1.000、1.000、0.996、0.995，均在0.99以上，符合特征圖譜相似度要求。選取蘆丁色譜峰（3號峰）作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果相對保留時間RSD均小于0.2%，相對峰面積RSD介于5.63%～33.04%。見表4。
3 討論
指標成分含量測定和特征圖譜建立的供試品溶液制備時，本試驗分別對提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇）和超聲提取時間（10、20、30 min）進行了考察。結果表明，50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇對蘆丁的含量測定結果無明顯影響，而經70%甲醇、100%甲醇提取所得特征圖譜較50%甲醇提取的色譜峰多且峰面積較大;提取時間對含量測定和特征圖譜無明顯影響，參照2015年版《中華人民共和國藥典》槐花項下含量測定方法，最終選擇100%甲醇超聲10 min對樣品進行提取。同時，本試驗對特征圖譜采用DAD檢測器進行全波長掃描，最終發現在波長為257 nm時色譜峰數目較多且峰形較好，故選定257 nm為檢測波長。
本試驗所選擇的標準湯劑制備工藝是根據《醫療機構中藥煎藥室管理規范》和國家藥典委員會公布的《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求（征求意見稿）》的要求進行煎煮后，經過固液分離、濃縮、冷凍干燥制成樣品。其中，煎藥器具的材質對于保證藥物化學成分具有至關重要的作用。南北朝時陶弘景提出“溫湯忌用鐵器”，李時珍又提到“煎藥并忌用銅鐵器，宜銀器、瓦罐”[11-12]。本試驗所用為陶瓷材質的煎藥壺，其壺口小，對揮發性成分和水分具有保護作用，從而提高煎煮效率，保證藥物療效。對于加水量，《太平圣惠方》提到“凡煮湯……其水數依方多少，不得參差”，可以看出加水量的重要性，不同藥性的藥物不可一概而論。在煎煮時間方面，由于不同的藥物具有不同的藥性，所需煎煮時間也不盡相同，有些藥物的成分會隨著煎煮時間延長而遭到破壞，易揮發物質損失會導致藥效降低?；被闆鲅寡?，屬于一般類藥物，故本試驗結合標準湯劑制備工藝要求，加水量以浸過藥面2～5 cm為宜，最終選擇一煎加水12倍，二煎加水10倍，煎煮時間選擇一煎30 min，二煎20 min[13-14]。
本試驗制備了15批槐花飲片標準湯劑，其出膏率范圍在28.7%～39.7%，采用HPLC測定蘆丁的含量介于105.26～127.35 mg/g、轉移率介于41.30%～75.67%，總黃酮含量介于158.07～210.55 mg/g、轉移率介于49.46%～73.19%。采用UPLC建立了槐花飲片標準湯劑的特征圖譜，標定了9個共有峰，指認了蘆丁1個色譜峰，15批槐花飲片標準湯劑與對照圖譜的相似度均大于0.99。特征圖譜克服了單一成分測定信息量不全的缺點，可以更加全面、可靠地控制槐花標準湯劑的質量。方法學考察結果表明，精密度、重復性、穩定性RSD均小于3%，表明本方法準確、可行、重復性良好，能為槐花配方顆粒的質量控制和臨床用藥提供數據參考。
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（修回日期：2018-08-12;編輯：陳靜）
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