葉酸促糖尿病腎病大鼠足微循環改善機制研究
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【摘要】目的：探討葉酸對糖尿病腎病大鼠足微循環的改善機制。方法：將25只健康雄性SD大鼠適應性喂養1周后隨機分為2組，分別為正常組（5只）和造模組（20只）。給模型組大鼠每天喂高脂高糖日糧，正常組喂基礎日糧。4周后稱量體重，造模大鼠空腹腹腔注射1%的鏈脲佐菌素溶液（sTZ，30mg/kg），正常組注射相等容量的檸檬酸鹽緩沖液。喂養2周后，測定正常組與模型組的血糖和胰島素水平。用基礎飼料統一喂養造模后的大鼠和正常組大鼠。模型大鼠隨機分為s證組、和低劑量（1.5mg/kg）、中劑量（3mg/kg）、高劑量（5mg/kg）葉酸組進行干預，再檢測大鼠鼠尾血糖濃度。各組均在干預灌胃3d后心臟無菌取血制備血清。在底面積75 cm2的培養瓶中加入完全培養基進行小鼠足細胞培養。將正常組和模型組小鼠足細胞的培養依次分為空白對照組、stz組、正常鼠血清對照組和添加低、中、高劑量葉酸血清組。刺激24h之后用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測大鼠血清VEGF水平，后通過PCR技術檢測mRNA中VEGF水平，后用蛋白質印跡法（wB）檢測蛋白質VEGF表達水平。結果：在高糖組和正常鼠血清組小鼠足細胞觀察到VEGF的陽性表達。添加葉酸的血清組足細胞VEGF在蛋白質和mRNA中的表達比高糖組和正常鼠血清組有所降低，差異具有統計學意義。結論：葉酸能夠介導血管內皮因子（VEGF）水平從而改善糖尿病腎病大鼠足的微循環。
【關鍵詞】葉酸 糖尿病腎病 足細胞 血管生長內皮因子
糖尿病腎病（DN）是目前糖尿病病人最重要的并發癥之一。在中國，糖尿病腎病的發病率呈現出明顯的上升趨勢。其中糖尿病腎病的發生機制中就有眾多細胞因子的活化，其中就包括血管內皮生長因子（VEGF）、血管生成素（Ang）等。研究人員在對糖尿病患者的長期觀察中發現血管內皮生長因子（VEGF）的濃度較非糖尿病患者顯著升高。已有研究表明補充葉酸能有效降低糖尿病腎病的發病率，但補充葉酸對降低糖尿病腎病的發病率的理論機制并不十分清楚。本研究假設通過補充葉酸能夠介導血管內皮因子（VEGF）水平從而改善糖尿病腎病大鼠足的微循環。現報告如下：
一、材料
?。?）動物。健康雄性sD大鼠25只，體重200～220g。
?。?）藥物。葉酸片購于天津力生葉酸片。分別配置低（1.5mg/kg）、中（3mg/kg）、高劑量（5mg/kg）葉酸。
二、實驗方法
?。ㄒ唬┓纸M與細胞培養
將25只健康雄性sD大鼠基礎喂養1周后隨機分為2組，分別為正常組（5只）和造模組（20只）。模型組大鼠喂每日喂養高脂高糖飼料（基礎飼料加20%的豬油、15%的蔗糖、5%的奶粉），正常組喂以基礎飼料。4周后，稱量體重。造模大鼠空腹腹腔注射1%的鏈脲佐菌素溶液（sTz，30mg/kg），正常組注射相同體積的檸檬酸鹽緩沖液。喂養2周后，在正常組和模型組中測量血糖和胰島素水平。模型組大鼠和正常組大鼠繼續喂食基礎飼料。將成模大鼠隨機分為正常對照組、1%鏈脲佐菌素溶液組（30mg/kg）和低（1.5mg/kg）、中（3mg/kg）、高劑量（5mg/kg）葉酸并注射1%鏈脲佐菌素溶液組（30mg/kg）組進行干預，干預后檢測大鼠鼠尾血糖濃度。在灌胃3天后心臟無菌取血制備血清。小鼠足細胞培養：將完全培養基加入到底面積為75cm2的培養瓶中進行培養。將正常組和模型組小鼠足細胞培養分為空白對照組（Nc）、stz高糖組（HG）、正常鼠血清對照組（NR）、和加入低劑量（LJ）、中劑量（N1））、高劑量（H1））葉酸血清組。
（二）指標檢測
?。?）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）計算確定實驗所需的板條數量，并將其取出后再放置于框架中。設置空白孔并僅添加TMB顯色液和終止液在空白孔中。對每次實驗進行標準測試，并繪制出標準曲線。將不同濃度標準品加入到相應孔中，并在室溫下溫育120分鐘。將板洗滌5次并加入生物素化的抗體工作溶液。在室溫下孵育60分鐘。將板洗滌5次，加入酶結合物工作溶液，在室溫下進行避光孵育20分鐘。將板洗滌5次，再加入顯色劑TMB100ul/孔，黑暗中溫室孵育20分鐘，加入50u1/孔的終止液，混合均勻后立刻測量0D450的值。
（2）熒光實時定量PCR技術用于檢測mRNA中VEGF水平。
?。?）免疫印跡法蛋白質印跡法（Western Blot）分析蛋白質中VEGF的表達水平
?。ㄈ┙y計學方法
使用SPSS17.0軟件進行數據分析。測量數據中計量資料表示為均數±標準差，統計方法使用單因素方差分析和LSD檢驗。
三、結果
?。ㄒ唬┟嘎撁庖呶皆囼灒‥LISA）測大鼠血清VEGF水平
正常組和高糖組的細胞漿與核周均可見VEGF陽性表達且表達量接近。然而，添加了低、中、高劑量的葉酸組中VEGF的表達較低。
?。ǘ晒鈱崟r定量PCR檢測mRNA中VEGF水平
添加葉酸組mRNA中VEGF表達水平較高糖組和正常鼠血清組明顯降低。（p<0.05）葉酸劑量與VEGF表達水平呈負相關。
?。ㄈ┑鞍踪|印跡法（Western Blot）檢測蛋白質VEGF表達水平
由表1結果可知與正常大鼠血清組相比高糖組中VEGF的表達情況明顯升高。添加不同劑量葉酸后各組大鼠VEGFmRNA表達量均有所降低。差異具有統計學意義。（P<0.05）
四、討論
VEGF（血管內皮生長因子）是促進血管新生的促血管生成因子。研究表明慢性高血糖癥能刺激VEGF合成和分泌，并引發一系列代謝和血液動力學效應，導致VEGF增加，并導致DM微血管并發癥。葉酸是一種水溶性維生素，在基因調控所需的甲基化過程中起著甲基供體的作用。Sonny Bherwani等人通過測量糖尿病腎病患者血清葉酸與尿微量白蛋白比值發現葉酸水平的下降與糖尿病腎病有關。葉酸的顯著降低使糖尿病腎病的機會增加19.9%。
本實驗結果顯示，糖尿病腎病小鼠的足細胞VEGF表達較對照小鼠高，顯示其在DN微血管病變中的意義重大。我們在飼料中添加不同劑量的葉酸，結果顯示添加葉酸的血清組小鼠足細胞VEGF在蛋白質和mRNA中的表達均較高糖組和正常鼠血清組降低，由此說明補充葉酸能夠介導血管內皮因子（VEGF）水平改善糖尿病腎病大鼠足的微循環。為降低糖尿病患者的發病率和死亡率提供了新的科學參考依據。
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