電針聯合兩色金雞菊提取物對糖尿病腎病大鼠腎臟Vimentin、α-SMA、TGF-β1及p-smad2表達的影響

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　　 摘要：目的  觀察電針聯合兩色金雞菊提取物對糖尿病大鼠腎臟波形蛋白（Vimentin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）及p-smad2表達的影響，探討其作用機制。方法  將36只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、電針組、兩色金雞菊組、電針+兩色金雞菊組和二甲雙胍組，每組6只。采用高糖高脂喂養聯合腹腔注射鏈脲佐菌素建立2型糖尿病模型。正常組、模型組不進行干預;電針組針刺大鼠雙側“腎俞”“脾俞”，連接電針，留針30 min;兩色金雞菊組予兩色金雞菊乙酸乙酯提取物（300 mg/kg）灌胃;電針+兩色金雞菊組予電針聯合兩色金雞菊乙酸乙酯提取物灌胃;二甲雙胍組予二甲雙胍（200 mg/kg）藥液灌胃。每日1次，治療4周。HE染色觀察腎組織形態學及纖維化程度，Western blot檢測腎組織Vimentin、α-SMA、TGF-β1及p-smad2蛋白表達。結果  HE染色結果顯示，電針組、兩色金雞菊組、電針+兩色金雞菊組和二甲雙胍組均可緩解模型大鼠腎小管擴張，減輕腎小球皺縮現象，改善炎性細胞浸潤，減少基底膜增生和融合，且以電針+兩色金雞菊組改善更明顯;Western blot檢測結果顯示，電針和兩色金雞菊提取物均可降低模型大鼠腎組織Vimentin、α-SMA、TGF-β1及p-smad2蛋白表達，且以兩者聯合效果最佳。結論  電針聯合兩色金雞菊提取物可明顯改善糖尿病大鼠腎臟纖維化，其作用機制可能與抑制TGF-β1/Smad2信號通路有關。
　　 關鍵詞：電針;兩色金雞菊提取物;糖尿病腎病;波形蛋白;α-平滑肌肌動蛋白;轉化生長因子-β1;Smad2;大鼠
　　 中圖分類號：R245;285.5    文獻標識碼：A    文章編號：1005-5304（2019）06-0055-04
　　Abstract： Objective To observe the effects of electroacupuncture combined with coreopsis tinctoria extract for expressions of Vimentin， α-SMA， TGF-β1 and p-smad2 in renal tissue of diabetic rats; To discuss its mechanism of action. Methods Totally thirty-six SD rats were randomly divided into normal group， model group， electroacupuncture group， coreopsis tinctoria group， electroacupuncture combined with coreopsis tinctoria group and metformin group， with 6 rats in each group. Type 2 DM model was established by high-fat and high-glucose diet and STZ injection intraperitoneally. Normal group and model group were given no treatment; Electroacupuncture was at the acupoints of “Pishu” and “Shenshu” once daily in electroacupuncture group for 30 min; coreopsis tinctoria group was given intragastric administration of 300 mg/kg coreopsis tinctoria extract for gavage; electroacupuncture combined with coreopsis tinctoria group was given electroacupuncture and intragastric administration of coreopsis tinctoria extract for gavage; metformin group was given intragastric administration of 200 mg/kg metformin for gavage. Histological changes and fibrosis degree of kidneys were observed by HE staining and expressions of Vimentin， α-SMA， TGF-β1 and p-smad2 were detected by Western blot. Results HE staining results indicated that
　　 糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）已成為終末期腎病的第2位致病因素[1]。終末期腎病一旦形成，治療極為棘手。因此，及時治療DN，防止其向終末期腎病轉化意義重大。腎臟纖維化是DN主要的病理特征之一，前期研究發現，兩色金雞菊提取物對高糖高脂誘導的大鼠腎小球系膜纖維化有明顯抑制作用[2-3]，而電針也可改善DN腎功能和超微結構[4]。本實驗擬將電針聯合兩色金雞菊提取物干預DN大鼠，觀察其對DN大鼠腎臟波形蛋白（Vimentin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）及p-smad2表達的影響，明確兩者是否存在協同作用，為臨床治療DN提供依據。
　　1  材料與方法 　　1.1  動物及分組
　　 SPF級雄性SD大鼠36只，體質量（250±5）g，新疆醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（新）2011-0004。飼養于溫度（21±2）℃、相對濕度40%～50%環境，明暗周期12 h，自由攝食飲水，適應性飼養7 d。
　　1.2  藥物
　　 兩色金雞菊乙酸乙酯提取物凍干粉，烏魯木齊三高和藥業有限公司，批號20170308;鹽酸二甲雙胍片，中美上海施貴寶制藥有限公司，批號 20150109。
　　1.3  主要試劑與儀器
　　 鏈脲佐菌素（Sigma公司），Vimentin、TGF-β1、Smad2及GAPDH抗體（Abcam公司），α-SMA抗體（美國CST公司）。G6805-1電針治療儀（青島鑫升實業有限公司），BX43顯微鏡（日本OLYMPUS公司），華佗牌0.30 mm×13mm一次性針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司）。
　　1.4  分組和造模
　　 采用隨機數字表法將大鼠分為正常組、模型組、電針組、兩色金雞菊組、電針+兩色金雞菊組和二甲雙胍組，每組6只。參考前期造模方法[5]，實驗大鼠高糖高脂飼料喂養3個月，腹腔注射1%鏈脲佐菌素（35 mg/kg），1周后檢測，隨機血糖>11.1 mmol/L視為造模成功。
　　1.5  干預
　　 正常組普通飼料喂養;其余各組造模后繼續高糖高脂飼料喂養;電針組造模后即刻予針刺雙側“脾俞”“腎俞”，穴位選擇參照《實驗針灸學》[6]常用實驗動物穴位圖譜取穴，“腎俞”位于第2腰椎旁開7 mm、“脾俞”位于12胸椎棘突下旁開7 mm，一次性針灸針直刺進針后連接電針儀，頻率2/10 Hz疏密波，電流1 mA，持續30 min;兩色金雞菊組予兩色金雞菊乙酸乙酯提取物（300 mg/kg，10 mL）灌胃;電針+色金雞菊組予電針聯合兩色金雞菊乙酸乙酯提取物灌胃;二甲雙胍組給予鹽酸二甲雙胍（200 mg/kg，10 mL）藥液灌胃。每日1次，連續4周。
　　1.6  取材
　　 干預4周后同步取材，戊巴比妥腹腔注射麻醉，切取雙腎，左腎置于4%甲醛中固定，用于HE染色;右腎置于液氮中固定，進行總蛋白提取及Western blot檢測。
　　1.7  HE染色
　　 4%甲醛中固定48 h后，石蠟包埋，切片（厚度約4 μm），常規梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）脫水，二甲苯脫蠟，經各級乙醇（70%、80%、90%、95%、100%）至水洗。蘇木素染色5 min，自來水沖洗;鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，置伊紅液2 min，脫水、透明，樹膠加蓋玻片封固。HE染色，光鏡下（×400）觀察并拍照。
　　1.8  Western blot檢測
　　 各組隨機取等量腎組織（100 mg）放入1.5 mL EP管中，加入1 mL預冷的組織蛋白裂解液，勻漿機研磨均勻，置于冰上裂解20 min，4 ℃、14 000×g離心10 min，取上清液，BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。取裂解蛋白50 μg，80 V電泳至濃縮膠與分離膠分界線處，然后換為100 V電泳70 min，肉眼觀察溴酚藍的條帶距膠底約1 cm停止電泳，換100 V電轉70 min，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗（Vimentin、α?SMA、Smad2、GAPDH抗體，1∶1000）4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，洗膜后加入顯影試劑，化學發光、顯影。Alpha Innotech? Fluor Chem FC2凝膠成像系統采集圖像，用Image J軟件對條帶計算蛋白表達的灰度值。以目的蛋白/GAPDH表示蛋白相對表達量。
　　1.9  統計學方法
　　 采用SPSS21.0統計軟件進行分析。實驗數據以±s表示，采用方差分析，服從正態分布且方差齊時組間比較用LSD-t法，方差不齊時用Welch檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。
　　2  結果
　　2.1  HE染色結果
　　 正常組大鼠腎小球結構完整，無明顯萎縮，基底膜清晰，無融合現象;模型組大鼠腎小管明顯擴張，腎小球萎縮，基底膜融合明顯，間質膠原增生明顯，炎性細胞浸潤;電針組、兩色金雞菊組、電針+兩色金雞菊組和二甲雙胍組大鼠腎小管擴張較模型組均有所緩解，腎小球皺縮現象有所減輕，炎性細胞浸潤改善，基底膜增生和融合減輕。電針+兩色金雞菊組改善更明顯。見圖1。
　　2.2  Western blot檢測結果
　　 與正常組比較，模型組大鼠腎組織Vimentin、α-SMA、TGF-β1和p-smad2蛋白表達明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，兩色金雞菊組和電針+兩色金雞菊組大鼠腎組織Vimentin、α-SMA和TGF-β1蛋白表達明顯降低（P<0.05，P<0.01），其中電針+兩色金雞菊組作用最明顯。見圖2、圖3。
　　3  討論
　　 DN是糖尿病患者最常見、最嚴重的并發癥之一，治療不及時可導致終末期腎病，危及生命安全。然而，針對本病，目前仍缺乏特異性的治療措施，臨床上多采用控制血糖、血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑等對癥治療，療效有限，并不能完全遏制本病的發展及惡化。
　　 本病屬中醫學“消渴”“水腫”“尿濁”等范疇，在臟腑多與脾、腎相關，其病機主要為氣陰兩虛。目前已有大量研究顯示，中藥、針灸對本病均有一定療效[7-9]。常用中藥主要有黃芪、雷公藤等，常用穴位有腎俞、足三里、三陰交、太溪、關元、脾俞、陰陵泉、合谷、中脘、太沖等[10]。兩色金雞菊又稱雪菊，原產于美國，近年來研究發現，其可顯著抑制高糖高脂誘導大鼠腎小球系膜細胞中纖維化因子的表達，減緩DN的進展[5]。 　　 本研究結果顯示，電針、兩色金雞菊提取物均可降低糖尿病大鼠腎臟中Vimentin、α-SMA蛋白的表達，2種治療方法對DN均有顯著療效，而兩者聯合其療效優于單一療法，在降低Vimentin、α-SMA蛋白表達的同時，伴有TGF-β1及p-smad2蛋白表達下降，說明電針和兩色金雞菊提取物可能是通過抑制TGF-β1/Smad2信號通路發揮作用的，且兩者聯合對改善糖尿病大鼠的腎功能具有協同作用。
　　 DN發病機制尚不完全清楚，研究表明，TGF-β1/smads信號通路與本病的發生發展密切相關[11]。TGF-β1屬于TGF-β家族，其表達水平過高可引起腎臟中成纖維細胞增長加快、細胞外基質產生增多，最終引起腎臟的纖維化。研究表明，針對TGF-β1進行干預可明顯改善糖尿病腎損害，是改善DN的一個有效靶點[12]。本研究結果也顯示，造模后，大鼠腎組織TGF-β1表達較正常組明顯升高，該結果與上述研究結果類似。經電針及色金雞菊提取物干預后，TGF-β1水平明顯下降，表明電針及色金雞菊提取物對TGF-β1均有抑制作用。TGF-β1的下游有多種信號通路，Smad是TGF-β1下游信號轉到的分子之一，主要包括Smad1～8，而Smad2被證明與DN的發病高度相關[13]。TGF-β1可磷酸化Smad2，活化的Smad2可與Smad4形成復合體，進入細胞核后引起腎臟纖維化相關蛋白的表達，進而引起腎臟損傷。本研究中模型大鼠p-smad2表達較正常組明顯升高，與其他研究結果一致[14-15]。經電針及色金雞菊提取物干預后，p-smad2水平明顯降低，表明電針及色金雞菊提取物可明顯抑制TGF-β1下游Smad2的表達。因TGF-β1/Smad2信號通路在DN中發揮重要作用，本研究推斷，電針聯合金雞菊提取物可通過抑制TGF-β1/Smad2信號通路發揮腎臟保護作用，且其療效優于單一療法，兩者具有協同作用。張楠楠等[16]研究也表明，TGF-β1/Smad2信號通路在兩色金雞菊提取物改善糖尿病腎纖維化方面起著重要作用。
　　 綜上，本研究認為電針聯合兩色金雞菊提取物可降低糖尿病腎臟纖維化相關蛋白的表達，發揮腎臟保護作用，兩者具有協同作用，其作用機制可能與抑制TGF-β1/Smad2信號通路有關。
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　　（收稿日期：2018-11-06）
　?。ㄐ藁厝掌冢?019-04-03;編輯：華強）
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