芪貞降糖顆粒質量標準研究
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[摘要] 目的 建立芪貞降糖顆粒的質量標準。 方法 采用薄層色譜法（TLC）對芪貞降糖顆粒中的黃芪進行定性鑒別；采用高效液相色譜（HPLC）法對芪貞降糖顆粒中的枸櫞酸、特女貞苷進行定量測定。色譜柱分別為Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相分別為0.1%磷酸水溶液、甲醇-水（36∶64），檢測波長分別為210、224 nm，進樣量分別為5.0、10.0 μL，柱溫均為30℃，流速均為1.0 mL/min。 結果 黃芪藥材的TLC特征斑點清晰，分離度好，陰性沒有干擾；HPLC測得枸櫞酸、特女貞苷分別在0.098 28～24.57 μg （r = 1.0000）、0.022 08～11.04 μg（r = 1.0000）范圍內與峰面積線性關系良好，平均加樣回收率分別為100.18%、96.08%（n = 9），且RSD分別為2.3%、2.8%，枸櫞酸、特女貞苷平均含量分別為46.9、1.02 mg/g。綜合考慮，暫定每袋芪貞降糖顆粒中枸櫞酸含量不低于400 mg，特女貞苷含量不低于12 mg。 結論 該方法準確、簡便、重復性良好，能夠很好地對芪貞降糖顆粒進行質量控制。
[關鍵詞] 芪貞降糖顆粒；質量標準；枸櫞酸；特女貞苷；高效液相色譜法；薄層色譜法
[中圖分類號] R286.0 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）05（a）-0033-05
Study on quality standard of Qizhen Jiangtang Granules
QIAN Cheng1，2，3 DING Liyu4 WANG Huanqing4 ZHANG Dan5 WU Fei1，2 FENG Yi1，2
1.Innovative Research Institute of Traditional Chinese Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China； 2.Engineering Research Center of Modern Preparation Technology of Traditional Chinese Medicine， Ministry of Education， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai， 201203， China； 3.Department of Pharmacy， Huadong Hospital Affiliated to Fudan University， Shanghai 200040， China； 4.Department of Pharmacy， Yueyang Hospital of Integrative Chinese and Western Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200437， China； 5.Department of Endocrinology， Yueyang Hospital of Integrative Chinese and Western Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200437， China
[Abstract] Objective To establish the quality standard for Qizhen Jiangtang Granules. Methods Astragali Radix were identified by thin layer chromatography （TLC）. The contents of citric acid and specnuezhenide were determined by high performance liquid chromatography （HPLC）. The columns were Agilent ZORBAX SB-Aq （4.6 mm×250 mm， 5 μm） and Kromasil 100-5 C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） with 0.1%phosphoric acid-water、methanol-water（36∶64）as the mobile phases， the flow rate was 1.0 mL/min， the detection wavelengths were 210 nm， 224 nm， the column temperature was 30℃ and the injection volumes were 5.0， 10.0 μL. Results TLC spots of Astragali Radix were clear with good resolution and without interference of negative samples. HPLC showed that the citric acid and specnuezhenide had good linear relationship with peak area in the range of 0.098 28-24.57 μg （r = 1.0000） and 0.022 08-11.04 μg （r = 1.0000） respectively. The average sample recovery rates were 100.18%， 96.08% （n = 9）， and the RSD were 2.3% and 2.8%， respectively. The average contents of citric acid and specnuezhenide were 46.9， 1.02 mg/g， respectively. Considering comprehensively， the contents of citric acid and specnuezhenide in each bag is not less than 400 mg and 12 mg respectively. Conclusion The method is accurate， simple and reproducible， and can control the quality of Qizhen Jiangtang Granules. [Key words] Qizhen Jiangtang Granules； Quality standard； Citric acid； Specnuezhenide； High performance liquid chromatography； Thin layer chromatography
芪貞降糖方由制烏梅、靈芝、黃芪和制女貞子4味中藥組成，臨床應用10余年，是用于治療糖調節異常和2型糖尿病的臨床驗方，在改善患者胰島素抵抗、調節糖代謝等方面療效顯著[1-6]。有研究[6-7]表明，枸櫞酸和特女貞苷是處方酸甘化陰的主要活性成分。本課題組前期[8-9]對該制劑中熱敏性成分濃縮工藝進行研究時，初步建立溶液中特女貞苷和枸櫞酸含量測定的高效液相色譜（HPLC）法，但未進行系統的方法學考察。為有效控制芪貞降糖顆粒質量、確保臨床療效，除常規項目外，本研究建立了黃芪成分的薄層色譜（TCL）鑒別法，并采用HPLC法測定芪貞降糖顆粒中枸櫞酸和特女貞苷的含量，以期有效控制制劑的質量。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
Agilent 1200型高效液相色譜儀（VWD檢測器，美國安捷倫科技有限公司）、Linomat 5型半自動點樣儀聯TLC visualizer成像系統（瑞典CAMAG公司）、XP205型分析天平（0.01 mg，梅特勒-托利多科技有限公司）、FA2104N型分析天平（0.1 mg，上海精密科學儀器有限公司）、Milli-Q型超純水機（密理博中國科技有限公司）。
1.2 試藥
枸櫞酸對照品（批號：100396-201302）、特女貞苷對照品（批號：111926-201404）、黃芪對照藥材（批號：121462-201304）均購自中國食品藥品檢定研究院；制烏梅（批號：150826，產地：浙江）、靈芝（批號：151201，產地：山東）、黃芪（批號：151112，產地：甘肅）、制女貞子（批號：151017，產地：湖南）均購自上?？禈蛑兴庯嬈酚邢薰?；硅膠G薄層板，購自煙臺市化學工業研究所；水為超純水；乙醇、磷酸等試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。芪貞降糖顆粒中試產品（批號：1606001、1606002、1606003，規格：20 g/袋），委托上海市寶龍藥業有限公司加工生產；陰性樣品為自制樣品。
2 方法與結果
2.1 黃芪的TLC鑒別
供試品溶液：將20 mL氨試液∶甲醇（1∶9）溶液加入研細后的4.0 g芪貞降糖顆粒（批號：1606001）中，超聲處理30 min，濾過，濾液水浴蒸干后以0.5 mL甲醇復溶，即得。
對照藥材和缺黃芪的陰性樣品溶液：取黃芪對照藥材0.6 g及按處方比例制備的芪貞降糖顆粒陰性樣品（缺黃芪），分別按供試品溶液制備方法處理，即得對照藥材和缺黃芪的陰性樣品溶液。
取上述3種樣品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以展開劑三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）下層溶液展開，以10%硫酸乙醇溶液顯色，并于105℃加熱至斑點顯色清晰，置于紫外燈（365 nm）下檢視。供試品與對照藥材在相應的色譜位置上顯同色熒光斑點，陰性對照樣品無干擾。見圖1（封四）。
2.2 枸櫞酸含量測定
2.2.1 色譜條件與系統適用性 Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.1%磷酸水溶液，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，檢測波長210 nm，進樣體積為5.0 μL[12-14]。
2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取枸櫞酸對照品49.14 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，制成濃度為4.914 mg/mL的溶液，并精密吸取1 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成濃度為0.4914 mg/mL的枸櫞酸對照品溶液。
2.2.3 供試品溶液制備 取芪貞降糖顆粒（批號：16060 01）0.25 g，精密稱定，加水25 mL，超聲5 min，冷卻，水補足減失重量，搖勻，12 000 r/min，高速離心10 min，離心半徑5.8 cm，取上清液，即得。
2.2.4 陰性樣品溶液制備 按處方及其比例稱取藥材（缺制烏梅），按“2.2.3”項下供試品溶液制備方法處理，即得制烏梅陰性樣品溶液。
2.2.5 專屬性試驗 精密吸取上述供試品、枸櫞酸對照品以及陰性樣品溶液各5.0 μL注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件測定。枸櫞酸保留時間為5.2 min，陰性雜質無干擾，提示本方法專屬性良好。見圖2。
2.2.6 標準曲線繪制 分別吸取0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μL的0.4914 mg/mL的枸櫞酸對照品溶液，注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件測定，以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，回歸方程：Y=67.34X+0.9540（r = 1.0000）。提示枸櫞酸在0.098 28～24.57 μg范圍內與峰面積線性關系良好。
2.2.7 精密度試驗 取枸櫞酸對照品溶液0.4914 mg/mL，注入高效液相色譜儀，連續進樣6針，按“2.2.1”項下色譜條件測定。其峰面積的RSD為0.16%，提示儀器精密度良好。
2.2.8 穩定性試驗 取芪貞降糖顆粒（批號：1606001）0.25 g，精密稱定，按“2.2.3”項下供試品溶液制備方法制備，于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.2.1”項下色譜條件測定，其峰面積RSD值為0.3%。提示供試品溶液在室溫條件下放置24 h基本穩定。
2.2.9 重復性試驗 取芪貞降糖顆粒0.25 g（批號：1606001）精密稱定，平行6份，按“2.2.3”項下供試品溶液制備方法制備，按“2.2.1”項下色譜條件測定。樣品的平均含量為46.47 mg/g，RSD值為2.4%，提示該方法重復性良好。 2.2.10 加樣回收率試驗 取已知含量的芪貞降糖顆粒（批號：1606001，枸櫞酸含量46.47 mg/g）9份，每份0.125 g，精密稱定，精密加入枸櫞酸對照品溶液（4.914 mg/mL）0.7、1.2、1.6 mL各3份，按“2.2.3”項下供試品溶液制備方法制備，按“2.2.1”項下色譜條件測定。平均加樣回收率為100.18%，RSD%為2.3%。提示該方法準確性良好。見表1。
2.2.11 含量測定及其限度的制訂 經過上述方法學試驗驗證，本法可用于芪貞降糖顆粒中枸櫞酸的準確測定[15]。分別取芪貞降糖顆粒（批號：1606001、1606002、1606003）0.25 g，精密稱定，按“2.2.3”項下供試品溶液制備方法制備，并按“2.2.1”項下色譜條件測定。3批中試樣品選用的制烏梅飲片中枸櫞酸含量較高（24.9%），與藥典規定的飲片合格標準相差較大。在工藝穩定的情況下，勢必導致芪貞降糖顆粒中的枸櫞酸含量差異懸殊。因此，以2015版《中華人民共和國藥典》對枸櫞酸含量的基本要求（不得少于12.0%）作為制烏梅飲片的基本數值，以3批中試的平均轉移率（56.6%）進行計算，每袋芪貞降糖顆粒應含有枸櫞酸500 mg，以其80%作為含量下限，故暫定每袋芪貞降糖顆粒中含制烏梅以枸櫞酸計算，不得低于400 mg/袋。見表2。
2.3 特女貞苷含量測定
2.3.1 色譜條件與系統適用性 Kromasil 100-5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流動相為甲醇-水（36∶64），柱溫30℃，流速1.0 mL/min，檢測波長為224 nm，進樣體積為10.0 μL。
2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取特女貞苷對照品11.35 mg（按97.3%計，實際含量為11.04 mg），置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解定容，制成濃度為1.104 mg/mL的溶液；分別精密吸取1 mL上述溶液，置于10 mL和25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成濃度為0.1104、0.044 16 mg/mL的特女貞苷對照品溶液[16-18]。
2.3.3 供試品溶液制備 取芪貞降糖顆粒（批號：16060 01）1 g，精密稱定，加稀乙醇25 mL，超聲提取5 min，冷卻，稀乙醇補足減失重量，搖勻，12 000 r/min高速離心10 min，離心半徑5.8 cm，取上清液。
2.3.4 陰性樣品溶液制備 按處方及其比例稱取余藥材制備陰性樣品（缺制女貞子），按“2.3.3”項下供試品溶液制備方法制備，即得陰性樣品溶液。
2.3.5 專屬性試驗 精密吸取上述供試品、特女貞苷對照品、陰性樣品溶液各10 μL，按“2.3.1”項下色譜條件測定。特女貞苷保留時間為15.3 min，陰性雜質無干擾，提示本法專屬性良好。見圖3。
2.3.6 標準曲線繪制 分別精密吸取濃度為1.104 mg/mL特女貞苷對照品溶液2.5、5.0、10.0 μL，濃度為0.044 16 mg/mL特女貞苷對照品溶液0.5、1.0、2.5、5、10 μL，按“2.3.1”項下色譜條件測定。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，回歸方程為：Y=1186X-0.5112（r = 1.0000），提示特女貞苷在0.022 08～11.04 μg與峰面積線性關系良好。
2.3.7 精密度試驗 精密吸取濃度為0.044 16 mg/mL的特女貞苷對照品溶液10.0 μL，重復進樣6次，計算峰面積的RSD值為1.0%，提示儀器精密度良好。
2.3.8 穩定性試驗 取芪貞降糖顆粒（批號：1606001）1 g，精密稱定，按“2.3.3”項下供試品溶液制備方法制備，于0、1、2、4、6、8、12、24 h按“2.3.1”項下色譜條件測定。供試品中特女貞苷峰面積的RSD值為1.2%，提示供試品溶液中特女貞苷室溫條件下放置24 h內穩定。
2.3.9 重復性試驗 取芪貞降糖顆粒（批號：1606001）1 g，平行6份，按“2.3.3”項下供試品溶液制備方法制備，按“2.3.1”項下色譜條件測定。供試品中特女貞苷的平均含量為1.01 mg/g，RSD值為1.3%，提示本法重復性良好。
2.3.10 加樣回收率試驗 取含量已知的芪貞降糖顆粒（批號：1606001，特女貞苷含量1.01 mg/g）9份，每份0.5 g，精密稱定，精密加入特女貞苷對照品溶液（1.104 mg/mL）0.3、0.5、0.7 mL各3份，按“2.3.3”項下供試品溶液制備方法制備，注入液相色譜儀，按“2.3.1”項下色譜條件測定。特女貞苷的平均回收率為96.08%，RSD值為2.8%，提示本法準確性良好[19]。見表3。
2.3.11 含量測定及其限度制訂 經上述方法學試驗驗證，本法可用于芪貞降糖顆粒中特女貞苷的準確測定。取芪貞降糖顆粒（批號：1606001、1606002、1606003）1 g，精密稱定，按“2.3.3”項下供試品溶液制備方法制備，并按“2.3.1”項下色譜條件測定。3批中試樣品選用了特女貞苷含量為1.02%的制女貞子飲片，其含量高于2015版《中華人民共和國藥典》制女貞子項下的含量要求。因此，以2015版《中華人民共和國藥典》對特女貞苷含量的基本要求（不得少于0.7%）作為制女貞子飲片的基本數值，以3批中試的平均轉移率（36.0%）進行計算，以其80%作為含量下限，故暫定每袋芪貞降糖顆粒中含制女貞子以特女貞苷計算，不得低于12 mg/袋。見表4。
3 討論
除常規的顆粒劑的制劑通則檢查項目外，本研究對原處方中除1味藥材外的剩余3味藥材分別開展定性定量研究，有效地控制了芪貞降糖顆粒質量，進而確保制劑的臨床療效和用藥安全。 枸櫞酸是芪貞降糖顆粒中君藥制烏梅的指標性成分，制烏梅中枸櫞酸含量高且在制劑工藝中轉移率高，是芪貞降糖顆粒質量標準研究的首選指標性成分。本研究建立了芪貞降糖顆粒中制烏梅的指標性成分枸櫞酸含量測定的HPLC法。本課題組在前期研究過程中[8-9]初步建立了芪貞降糖方提取液和濃縮液中枸櫞酸的含量測定方法且專屬性合格，在芪貞降糖顆粒質量標準研究過程中，進一步通過色譜柱篩選和優化分離條件，故本研究建立分離條件可以對顆粒中枸櫞酸進行準確定量測定。
枸櫞酸又稱為檸檬酸，是植物界代表性的有機酸，廣泛存在于各種中藥中，《中華人民共和國藥典》中烏梅、山楂等飲片均以此作為指標性成分，其含量較高、水溶性好且熱穩定性佳，是制劑較為理想的檢測指標。然而，正因為枸櫞酸存在的廣泛性，故一般復方質量標準研究時測定的專屬性不易符合要求，且枸櫞酸結構為無共軛結構的三羧酸，極性大且無紫外吸收，使用HPLC檢測時的干擾較多，不易定量。本研究通過系統的方法學考察，建立了芪貞降糖顆粒中枸櫞酸含量測定的HPLC方法，對其他類似復方制劑的質量控制具有較好的借鑒價值。
前期研究[9]證明處方制女貞子中特女貞苷具有熱敏性，是制劑工藝可靠性監控的重要指示性成分，且在最終產品中含量水平也符合中藥制劑定量指標的基本要求[20]，作為顆粒質量標準的定量檢測指標是合理的。
本研究建立和優化了黃芪的薄層色譜鑒別方法，針對黃芪中多種皂苷在堿液處理過程中會相互轉換的規律，在2015版《中華人民共和國藥典》黃芪項下含量測定前處理的基礎上，建立了堿化甲醇作為提取溶劑的前處理方法，此方法所得TLC斑點專屬性強、清晰度高、分離度好、重現性佳且操作方法快速、簡便。
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