補腎祛瘀顆粒的質量標準研究

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　　摘 要 目的：建立補腎祛瘀顆粒的質量標準。方法：采用薄層色譜（TLC）法對補腎祛瘀顆粒中的金櫻子、菟絲子、制何首烏、紫草進行定性鑒別；采用紫外分光光度法測定補腎祛瘀顆粒中總多糖的含量；采用高效液相色譜（HPLC）法對補腎祛瘀顆粒中蘆丁、槲皮素、金絲桃苷進行含量測定，色譜柱為BDS C18，流動相為乙腈-0.08%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為370 nm，進樣量為10 μL。結果：4種藥材的TLC供試品色譜與對照品或對照藥材在相應位置上呈現相同斑點或熒光。葡萄糖、蘆丁、槲皮素、金絲桃苷的檢測質量濃度線性范圍分別為0.003～0.018 mg/mL、0.225～7.20 μg/mL、0.07～2.24 μg/mL、1.25～39.88 μg/mL（r=0.999 5或0.999 9，n=6），精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均≤3.80%（n=6），平均回收率分別為102.2%、101.2%、100.9%、101.0%（RSD=1.28%、2.93%、2.41%、1.59%，n=6），平均含量分別為0.46 g/g、5.48 μg/g、8.18 μg/g、102.88 μg/g（n=3）。結論：本研究建立的補腎祛瘀顆粒的質量標準準確可靠，可為補腎祛瘀顆粒的質量控制提供科學依據。
　　關鍵詞 補腎祛瘀顆粒；質量標準；薄層色譜法；紫外分光光度法；多糖；高效液相色譜法；蘆?。婚纹に?；金絲桃苷
　　Study on Quality Standard of Bushen Quyu Granules
　　LU Wanfei1，GU Chaoqun2，MA Jiali2，YUAN Qiang2（1.Dept. of Clinical Pharmacy， Qinzhou Municipal Hospital of TCM， Guangxi Qinzhou 535000， China；2.College of Pharmacy， Zhejiang University of TCM， Hangzhou 310053， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the quality standard for Bushen quyu granules. METHODS： TLC was used for qualitative identification of Rosa laevigata， Cuscuta chinensis， processed Fallopia multiflora and Lithospermum erythrorhizon in Bushen quyu granules. And then， the content of total polysaccharides in Bushen quyu granules was determined by UV spectrophotometry. HPLC method was used for the content determination of rutin， quercetin and hyperin in Bushen quyu granules. The determination was performed on BDS C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.08% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and detection wavelength was set at 370 nm. The sample size was 10 μL. RESULTS： TLC test sample chromatogram of 4 medicinal materials showed the same spot or fluorescence at the corresponding position with the reference substance and control medicinal materials. The linear range of glucose， rutin， quercetin and hyperin were 0.003-0.018 mg/mL， 0.225-7.20 μg/mL， 0.07-2.24 μg/mL and 1.25-39.88 μg/mL（r=0.999 5 or 0.999 9， n=6）. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all less than 3% （n=6）. Average recoveries were 102.2%， 101.2%， 100.9%， 101.0% （RSD=1.28%， 2.93%， 2.41%， 1.59%， n=6）. Average contents were 0.46 g/g， 5.48 μg/g， 8.18 μg/g and 102.88 μg/g（n=3）. CONCLUSIONS： Established quality standard of Bushen quyu granules is accurate and reliable， and can provide scientific reference for quality control of Bushen quyu granules.
　　KEYWORDS Bushen quyu granules； Quality standard； TLC； UV spectrophotometry； Total polysaccharide； HPLC； Rutin； Quercetin； Hyperin 　　免疫球蛋白A（IgA）腎病是最常見的原發性腎小球疾病，約占原發性腎小球疾病的20%～47%[1]，是以免疫復合物沉積于系膜區為特征的腎小球腎炎，多以血尿、蛋白尿、高血壓及腎功能損傷為主要臨床表現[2-3]，該病常由于病程遷延而發展成慢性腎衰。目前對于IgA腎病的發病機制尚不清楚，至今仍無非常有效的治療方法，在患有IgA腎病的患者中，有30%～40%在10年后進展為終末期腎病（ESRD）[1]。中醫對IgA腎病患者進行辨證論治時，發現本虛是IgA腎病發病的根本原因，在疾病過程中，往往因虛致實，產生以熱毒、濕熱、瘀血為主的標實之證，而熱毒、濕熱、瘀血又成為使病情惡化加重的病理因素[2-3]。補腎祛瘀方由金櫻子、菟絲子、紫草、制何首烏和三七組成，金櫻子、菟絲子為君藥，具補肝益腎，澀腸止瀉之功效；紫草為臣藥，具清熱涼血、活血、解毒透疹之功效；三七具化瘀止血、活血定痛之功效，何首烏具補肝腎，芡實具益腎固精之功效[4]，三者共為佐藥。臨床上多以該方湯劑為主，但是由于湯劑不便患者攜帶及服用，現筆者將其制成補腎祛瘀顆粒。
　　為確保補腎祛瘀顆粒臨床用藥的安全性和有效性，保證產品質量，本課題組參照2015年版《中國藥典》（一部）中藥材的相關規定對補腎祛瘀顆粒中的藥材金櫻子、菟絲子、制何首烏、紫草采用薄層色譜（TLC）法進行定性鑒別，以紫外分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）對補腎祛瘀顆粒中君藥主要化學成分總多糖、蘆丁、槲皮素、金絲桃苷進行定量分析，為補腎祛瘀顆粒的質量控制提供依據。
　　1 材料
　　1.1 儀器
　　Waters 2695Series HPLC儀（美國Waters公司）；UV-2550紫外可見分光光度計（日本島津公司）；AB135十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Sartorius-BS110S分析天平（德國Sartorius公司）；HH-2數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。
　　1.2 藥品與試劑
　　D-無水葡萄糖對照品（批號：110833-200503）、蘆丁對照品（批號：100080-200707）、金絲桃苷對照品（批號：111521-201205）、槲皮素對照品（批號：100081-200907）、制何首烏對照藥材（批號：121454-200703）、紫草（新疆）對照藥材（批號：121430-201103）、金櫻子對照藥材（批號：121047-201003）均購自中國食品藥品檢定研究院；金櫻子（批號：110827）、菟絲子（批號：110302）、芡實（批號：110215）、紫草（批號：101018）、制何首烏（批號：110307）、三七（批號：110210）原藥材均購自浙江中醫藥大學中藥飲片廠，經浙江中醫藥大學藥學院宋捷民教授鑒定為真品；乙腈、甲醇均為色譜純，其他試劑均為分析純。
　　2 方法與結果
　　2.1 補腎祛瘀顆粒的制備
　　取處方量的金櫻子、菟絲子、芡實藥材，加12倍量水，回流提取3次，每次1.5 h，提取后過濾（藥渣備用），濃縮，濃縮液加入適量無水乙醇（乙醇終體積分數為80%），靜置24 h，過濾，濾液減壓干燥，得浸膏（得率為10.22%），再烘干，粉碎成粉末；上述藥渣加入處方量紫草和制首烏，加入10倍量的80%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h，過濾濃縮，減壓干燥得浸膏（得率為11.81%）。將粉末、浸膏和處方量的三七粉混合，加入1.5倍的輔料糊精，加入輔料總質量4%的木糖醇，混合均勻，噴以75%乙醇制軟材、制粒、整粒，包裝（每袋18 g，相當于生藥材59 g）。共制得10批補腎祛瘀顆粒（批號分別為20170808、20170809、20170810、20170811、20170812、20170813、20170814、20170815、20170816、20170817），存于干燥缸中備用。
　　2.2 補腎祛瘀顆粒的定性鑒別
　　2.2.1 金櫻子的TLC鑒別 取補腎祛瘀顆粒（批號：20170814，下同）3 g，研細，加80%乙醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，再加水20 mL使溶解，用乙酸乙酯提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯部位，蒸干，加甲醇2 mL溶解，作為金櫻子供試品溶液。取金櫻子對照藥材1.0 g，同上述方法制備金櫻子對照藥材溶液。取金櫻子原藥材1.0 g，同上述方法制備金櫻子原藥材溶液。取缺金櫻子和菟絲子處方藥材（2種藥材化學成分相近），同上述方法制備陰性樣品溶液。按照2015年版《中國藥典》（四部）通則0502[4]進行試驗，分別吸取上述4種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（5 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 0.1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于110℃加熱至斑點顯色清晰。結果，在金櫻子供試品溶液色譜與對照藥材溶液色譜相應的位置上，顯示相同斑點，陰性樣品沒有干擾。金櫻子的TLC圖見圖1。
　　2.2.2 菟絲子的薄層鑒別 取補腎祛瘀顆粒3 g，研細，加甲醇40 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液濃縮至5 mL，作為菟絲子供試品溶液。另取金絲桃苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg金絲桃苷的溶液，作為金絲桃苷對照品溶液。取菟絲子原藥材1.0 g，同上述方法制得菟絲子原藥材溶液。取缺金櫻子和菟絲子的處方藥材，混合，同上述方法制得陰性樣品溶液。按照2015年版《中國藥典》（四部）通則0502[4]進行試驗，分別吸取上述4種溶液各2 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇-冰醋酸-水（4 ∶ 1 ∶ 5，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁溶液，置于紫外光燈（波長：365 nm）下檢視。結果，在菟絲子供試品溶液色譜與對照品溶液色譜、對照藥材色譜相應的位置上，顯示相同斑點，陰性樣品沒有干擾。菟絲子的TLC圖見圖2。 　　2.2.3 紫草的薄層鑒別 取補腎祛瘀顆粒3 g，研細，加石油醚（60～90 ℃）20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至約1 mL，作為紫草供試品溶液。取紫草對照藥材適量，研細，取粉末0.25 g，同上述方法制備紫草對照藥材溶液。取紫草原藥材1.0 g，同上述方法制備紫草原藥材溶液。取缺紫草的處方藥材，同上述方法制備方法制得陰性對照品溶液。按照2015年版《中國藥典》（四部）通則0502[4]進行試驗，分別吸取上述4種溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5 ∶ 5 ∶ 0.5 ∶ 0.1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液，觀察。結果，在紫草供試品溶液色譜與對照藥材溶液色譜相應的位置上，顯示相同斑點，陰性樣品沒有干擾。紫草的TLC圖見圖3。
　　2.2.4 制首烏的薄層鑒別 取補腎祛瘀顆粒3 g，研細，加乙醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至3 mL，作為制首烏供試品溶液。取制首烏對照藥材適量，研細，取粉末0.25 g，同上述方法制備制首烏對照藥材溶液。取制首烏原藥材1.0 g，同上述方法制備制首烏原藥材溶液。取缺制首烏的處方藥材，同上述方法制備方法制得陰性樣品溶液。按照2015年版《中國藥典》（四部）通則0502[4]進行試驗，分別吸取上述4種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠H薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（7 ∶ 3，V/V）為展開劑，展開至約3.5 cm，取出，晾干，再以三氯甲烷-甲醇（20 ∶ 1，V/V）為展開劑，展開至約7 cm，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，在制首烏供試品溶液色譜與對照藥材溶液色譜相應的位置上，顯示相同斑點，陰性樣品沒有干擾。制何首烏的TLC圖見圖4。
　　2.3 補腎祛瘀顆粒總多糖含量測定
　　2.3.1 溶液的制備 （1）對照品溶液制備：取105 ℃干燥至恒質量的D-無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水稀釋成質量濃度為0.6 mg/mL的溶液，即得。（2）供試品溶液的制備：取補腎祛瘀顆粒粉末約0.5 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加水至刻度線，超聲30 min，放冷，定容到刻度線，過濾，取續濾液0.2 mL加水定容至25 mL，即得。
　　2.3.2 測定波長的選擇 參考相關文獻[5-7]方法，取“2.3.1”項下對照品溶液1 mL，置于25 mL量瓶中，定容，吸取2 mL至具塞試管，加入1 mL苯酚，搖勻，迅速沿著試管壁滴加5 mL濃H2SO4，搖勻，放置5 min，置沸水中加熱15 min，取出，冷卻至室溫，得供試溶液。另以蒸餾水2 mL，同上述方法操作，得空白對照溶液。取適量上述2種溶液于紫外可見分光光度計400～600 nm波長處掃描，結果，在489 nm波長處有最大吸收峰，因此選定其為測定波長。
　　2.3.3 線性關系考察 取“2.3.1”項下對照品溶液各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，定容至10 mL量瓶中，得系列溶液。再分別各取2 mL溶液，加入1 mL苯酚、5 mL濃H2SO4，于沸水中加熱15 min，冷卻至室溫。然后于489 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標（y），系列溶液的質量濃度為橫坐標（x），進行線性回歸，得回歸方程為y=61.095x+0.001（r=0.999 5，n=6），結果表明，葡萄糖檢測質量濃度線性范圍為0.003～0.018 mg/mL。
　　2.3.4 精密度試驗 取“2.3.1”項下供試品溶液適量，重復測定6次，并計算總多糖含量。結果，總多糖含量的RSD=0.19%（n=6），表明本方法精密度良好。
　　2.3.5 穩定性試驗 取“2.3.1”項下供試品溶液2 mL，按“2.3.2”項下“加入1 mL苯酚……冷卻至室溫”方法操作，每隔10 min測定溶液吸光度值（50 min后停止測定）。結果，總多糖含量的RSD=0.9%（n=6），表明供試品溶液在50 min內的穩定性良好。
　　2.3.6 重復性試驗 取同一批號（批號：20170808）的樣品6份，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.3.2”項下“加入1 mL苯酚……冷卻至室溫”方法操作，測定總多糖含量。結果，6份樣品總多糖含量的RSD=2.53%（n=6），表明本方法重復性良好。
　　2.3.7 加樣回收率試驗 取已知總多糖含量的樣品6份，分別加入一定比例的對照品溶液制成供試品溶液，按“2.3.2”項下“加入1 mL苯酚……冷卻至室溫”方法操作，測定總多糖含量。結果，總多糖平均回收率為102.2%（RSD=1.28%，n=6），詳見表1。
　　2.3.8 樣品含量測定 取3批樣品（批號：20170808、20170809、20170810），“2.3.1”項下方法制備樣品溶液，然后按“2.3.2”項下“加入1 mL苯酚……冷卻至室溫”方法操作，測定樣品中總多糖的含量。結果補腎祛瘀顆粒中總多糖平均含量為0.46 g/g，詳見表2。
　　2.4 補腎祛瘀顆粒中蘆丁、槲皮素、金絲桃苷的含量測定
　　2.4.1 色譜條件 色譜柱為BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.08%磷酸（B）（A ∶ B，V/V），梯度洗脫；流速為1 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為370 nm；進樣量為10 μL。梯度洗脫條件見表3。
　　2.4.2 溶液的制備 （1）混合對照品溶液的制備：取蘆丁、槲皮素、金絲桃苷對照品適量，精密稱定，用甲醇制成質量濃度分別為7.20、2.24、39.88 μg/mL的混合對照品溶液。（2）供試品溶液的制備：取補腎祛瘀顆粒（批號：20170808）2 g，研細，精密稱定，用70%甲醇40 mL超聲提取1 h，然后用石油醚萃取3次，每次10 mL，取甲醇層加10 mL乙酸乙酯和5 mL水繼續萃取，取水層用乙酸乙酯繼續萃取3次，10 mL/次，除去水層，蒸干乙酸乙酯層，用甲醇定容至2 mL，搖勻，濾過，即得。（3）陰性供試品溶液的制備：以甲醇溶液為陰性供試品溶液。 　　2.4.3 專屬性考察 取“2.4.2”項下的3種溶液各10 μL，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，供試品溶液與對照品溶液中各相鄰峰間分離度均大于1.5，以蘆丁、槲皮素、金絲桃苷計，理論板數均>2 000。高效液相色譜圖見圖5。
　　2.4.4 線性關系考察 精密吸取“2.4.2”項下混合對照品溶液適量，稀釋成系列質量濃度溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以系列溶液質量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸。結果蘆丁、槲皮素、金絲桃苷的回歸方程分別為y=14 287x-394、y=49 778x-679.16、y=17 706x-2 170.1（r均為0.999 9，n=6），檢測質量濃度線性范圍分別為0.225～7.20、0.07～2.24、1.25～39.88 μg/mL。
　　2.4.5 檢測限與定量限考察 分別精密稱取蘆丁、槲皮素、金絲桃苷對照品適量，用甲醇制成質量濃度為6.99、2.10、37.66 μg/mL的溶液，然后按一定比例稀釋，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。當信噪比為10 ∶ 1時，得定量限；當信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限。結果，蘆丁、槲皮素、金絲桃苷的定量限分別為0.09、0.04、0.015 μg/mL，檢測限分別為0.05、0.01、0.004 μg/mL。
　　2.4.6 精密度試驗 精密吸取“2.4.2”項下混合對照品溶液10μL，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定6次，記錄蘆丁、槲皮素、金絲桃苷的峰面積。結果，蘆丁、槲皮素、金絲桃苷峰面積的RSD分別為1.45%、1.99%、1.86%（n=6），表明儀器精密度良好。
　　2.4.7 穩定性試驗 取“2.4.2”項下供試品溶液適量，分別于室溫放置0、2、4、6、8、12 h時，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄蘆丁、槲皮素、金絲桃苷的峰面積。結果，蘆丁、槲皮素、金絲桃苷峰面積的RSD分別為3.80%、1.35%、2.28%（n=6）。表明供試品溶液中蘆丁、槲皮素、金絲桃苷的穩定性良好。
　　2.4.8 重復性試驗 取同一批號（批號：20170808）的樣品，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液6份，再按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄蘆丁、槲皮素、金絲桃苷的峰面積。結果，蘆丁、槲皮素、金絲桃苷峰面積的RSD值分別為2.96%、1.97%、2.80%（n=6），表明本方法重復性良好。
　　2.4.9 加樣回收率試驗 取已知蘆丁、槲皮素、金絲桃苷含量的樣品6份，精密稱定，加入一定量的蘆丁、槲皮素、金絲桃苷對照品，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結果，蘆丁、槲皮素、金絲桃苷平均回收率分別為101.2%、100.9%、101.0%，RSD分別為2.93%、2.41%、1.59%（n=6），測定結果見表4。
　　2.4.10 樣品含量測定 取3批（批號：20170808、2017- 0809、20170810）樣品，研細，取粉末約1 g，精密稱定，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄蘆丁、槲皮素、金絲桃苷的峰面積并計算含量。結果，3批樣品中的蘆丁、槲皮素、金絲桃苷平均含量分別為5.48、8.18、102.88 μg/g，RSD分別為1.90%、2.31%、1.46%，詳見表5。
　　3 討論
　　相關研究發現，將湯劑加工制備成顆粒，不僅保留了有效成分，還能方便消費者使用[8]。本研究對補腎祛瘀顆粒中金櫻子、菟絲子、紫草、制何首烏藥材采用TLC法進行定性鑒定，由于藥材中金櫻子與菟絲子的化學成分相似[9-12]，因此，筆者在TLC鑒別試驗中制備陰性樣品時，同時缺少這2種藥材。結果表明TLC分離效果良好，斑點顯示清晰；以紫外分光光度法測定補腎祛瘀顆粒中總多糖，結果表明定量分析方法精密度、穩定性、重復性良好。相關研究報道，治療IgA腎病相關藥物的有效成分多為多糖類、黃酮類[13-15]，因此為補腎祛瘀顆粒治療IgA腎病提供了依據。筆者根據本試驗結果，初步擬定補腎祛瘀顆粒質量標準限度值（按含量測定結果平均值的80%計算），確定每1 g補腎祛瘀顆?？偠嗵呛坎坏玫陀?.37 g、蘆丁不得低于4.38 μg、槲皮素不得低于6.54 μg、金絲桃苷不得低于82.30 μg。
　　綜上所述，本文采用多指標綜合評價補腎祛瘀顆粒的質量，與單一指標評價相比更具有科學性，本文也初步擬定了補腎祛瘀顆粒中總多糖、蘆丁、槲皮素、金絲桃苷的質量控制標準，為補腎祛瘀顆粒質量控制及質量標準的制定提供科學依據。
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