苦參功勞顆粒對人工感染雞大腸桿菌病的臨床療效研究

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　　摘要 [目的]評價苦參功勞顆粒對雞大腸桿菌病的治療效果，確定推薦的給藥程序。[方法]通過采用標準菌株C83851 建立人工感染雞大腸桿菌病模型，給予高、中、低劑量的苦參功勞顆粒治療，觀察治療前后的臨床癥狀、增重率，死亡率和治愈率，評價其臨床效果。[結果] 苦參功勞顆粒按0.1、0.2、0.4 g/kg體重的劑量灌胃給藥，連續5 d，治愈率分別為67.5%、77.5%和80.0%，體重增重率分別為56.91%、63.56%和61.36%。[結論] 苦參功勞顆粒可以有效治療雞大腸桿菌病，推薦劑量為0.2 g/kg。
　　關鍵詞 苦參功勞顆粒;雞大腸桿菌病;治療
　　中圖分類號 S858.31文獻標識碼 A
　　文章編號 0517-6611（2019）10-0082-04
　　Abstract [Objective] To evaluate the treatment effects of Kushen Gonglao granule against chicken colibacillosis，and confirm the recommended drug administration procedure.[Method] The standard strain C83851 was used for establishing artificiallyinfected chicken colibacillosis model.Three different doses of Kushen Gonglao granule was administrated to the infected broilers.The  clinical symptoms before and after the treatment，weight gain rate，mortality rate and cure rate were observed，and the clinical effects was evaluated.[Result] Mice were administrated with 0.1，0.2 and 0.4 g/kg by gastrointestinal administration for continuous 5 days，the cure rates of infected chicken were 67.5%，77.5% and 80.0%，respectively，and the weight gain rates in three treatments were 56.91%，63.56% and 61.36% respectively.[Conclusion]Kushen Gonglao granule could effectively treat the chicken colibacillosis.
　　Key words Kushen Gonglao granule;Chicken colibacillosis;Treatment
　　雞大腸桿菌病是一種由致病性大腸桿菌引起的急性或慢性傳染病，具有發病率高、發病快、死亡率高的特點，給養殖業造成嚴重的經濟損失[1-2]。作為條件致病菌，大腸桿菌普遍存在于患病雞、隱性感染雞的體內以及養殖場環境中，且由于血清型眾多，各血清型間交叉保護低，尚無有效疫苗進行免疫預防[3-4]。目前，在飲水或飼料中添加抗生素是預防和治療雞大腸桿菌病的主要手段，然而由于抗菌藥的長期不合理使用，導致細菌耐藥性日益嚴重，臨床上分離多重耐藥菌的報道日益增多[5]。此外，由于長期在飼料中添加抗菌藥物導致的動物源性食品藥物殘留威脅公眾的生命健康安全，我國開始實施藥物飼料添加劑退出計劃，給養殖業大腸桿菌病防控帶來新的挑戰?？鄥⒐陬w粒是按傳統中獸醫理論開發的中獸藥復方制劑，由十大功勞、苦參、木香3味藥物組成，藥效學研究表明苦參功勞顆粒對人工感染大腸桿菌的小鼠具有治療作用[6]。為了考察苦參功勞顆粒對雞大腸桿菌病的臨床治療效果，筆者采用人工感染疾病模型進行臨床效果評價。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 藥品。 苦參功勞顆粒，批號20140401，規格為每1 g相當于原生藥3 g，購自洛陽惠中獸藥有限公司;四黃止痢顆粒，批號為20130901，規格為100 g∶100 g（原生藥），購自普萊柯生物工程股份有限公司。
　　1.1.2 供試菌株。 O78型雞大腸桿菌C83851，購自中國獸醫藥品監察所菌種保藏中心。
　　1.1.3 主要試劑。 營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基，均購于青島高科園海博生物技術有限公司;氯化鈉購自天津市風帆化學試劑科技有限公司。
　　1.1.4 主要儀器。 DT1000天孚牌電子天平，為常熟市金羊砝碼儀器有限公司產品;核酸蛋白測定儀，型號6132型，為德國Eppendorf公司產品;全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器，YXQ-LS-100A型，為上海博迅實業有限公司醫療設備廠產品;生物安全柜，Nu-425-400S型，為美國Nuaire公司產品;電熱恒溫培養箱，DNP-9272BS-Ⅲ型，為上海新苗醫療器械制造有限公司產品;恒溫搖床，HHWY-200型，為常州諾基儀器有限公司產品。
　　1.1.5 試驗動物。 1日齡健康海蘭褐殼蛋公雛300只，由洛陽市畜康牧業公司提供。
　　1.2 方法
　　1.2.1 試驗菌液的制備。 取大腸桿菌C83851的第2代甘油保存物，接種于10 mL營養肉湯中，37 ℃、150 r/min振蕩培養16 h進行復壯;用接種環挑取新鮮菌液劃線接種于營養瓊脂平板上，37 ℃培養16 h進行菌種純化。從純化后的瓊脂板上取典型單菌落6個接種于100 mL營養肉湯中，37 ℃、150 r/min振蕩培養12 h進行增菌培養，備用。 　　使用時，取增菌培養的菌液進行10倍稀釋后，以營養肉湯為空白對照，測定600 nm波長處的OD值，并添加營養肉湯調節OD值為0.34～0.36，此時菌液濃度為2.5×108 CFU/mL。根據稀釋時加入肉湯的量，估測原菌液的濃度為3.0×109 CFU/mL，并根據估測結果，將菌液進行6倍稀釋，此時菌液濃度約為5.0×108 CFU/mL。
　　1.2.2 動物分組。 取1日齡健康雛雞240只，正常飼養18 d后隨機分為6組，每組40只，分別為健康對照組、攻毒對照組、苦參功勞顆粒低劑量組、苦參功勞顆粒中劑量組、苦參功勞顆粒高劑量組和對照藥物組。
　　1.2.3 人工感染雞大腸桿菌模型的建立。健康對照組雛雞胸肌注射0.2 mL營養肉湯，另外5組進行攻毒，雛雞胸肌注射0.2 mL濃度約5.0×108 CFU/mL的大腸桿菌菌液。攻毒的同時將上述菌液進行10倍系列稀釋至107倍，分別取106倍、107倍稀釋的菌液0.1 mL，滴加于營養瓊脂平板表面，涂抹棒涂抹均勻，進行活菌計數，計算攻毒用菌液的實際濃度。
　　1.2.4 模型判定標準。攻毒后4 h，逐只觀察雞群發病情況，當感染模型符合如下標準則判斷模型建立成功。臨床癥狀如下：雞只出現精神沉郁、耷尾拖翅、閉眼縮頸、腹瀉或肛周有糞便污染等。病理剖檢：死亡剖檢發現病雞可見典型的心包炎、肝周炎等纖維素滲出炎癥。病原分離：無菌操作條件下采集死亡雞只心臟、肝臟樣品，接種于麥康凱培養基，37 ℃過夜培養后挑出粉紅色、光滑的單個菌落接種于伊紅美藍培養基上，37 ℃過夜培養，若出現有金屬光澤的菌落則鑒定為雞大腸桿菌。
　　1.2.5 苦參功勞顆粒對人工感染雞大腸桿菌病的療效試驗
　　1.2.5.1 給藥。 攻毒后4 h試驗各組按表1給藥方案開始給藥，給藥前苦參功勞顆粒高、中、低劑量組預先用純化水配成濃度分別為140、70、35  mg/mL的溶液，四黃止痢顆粒配成濃度為70 mg/mL的溶液，各組采用灌胃方式進行給藥，給藥量0.5 mL/只，連續給藥5 d。
　　1.2.5.2 療效觀察。每天觀察雞只的臨床癥狀，連續觀察19 d，并針對精神狀態、行為活動、被毛狀態、釆食行為進行計分，每項分3～4個級別，具體評分標準見表2。
　　1.2.6 療效評價標準。
　　1.2.6.1 增重率。試驗過程中，試驗前稱取各組雞只的始重，試驗結束時稱取各組雞只末重，根據始重與末重，計算試驗期間各組雞群的增重率。
　　增重率=其他組平均末重-其他組平均始重健康對照組平均末重-健康對照組平均始重×100%（3）
　　1.2.6.2 死亡率。 試驗期間的死亡雞只，解剖后有心包炎、肝周炎、腹膜炎、氣囊炎等典型癥狀，取肝臟、心臟經麥康凱瓊脂培養有大腸桿菌生長者判為發病死亡，根據各組發病死亡動物數與該組動物總數，計算死亡率。
　　死亡率=各組死亡動物數該組動物總數 ×100%（4）
　　1.2.6.3 治愈率。試驗期間給藥組雞只接受治療后，臨床癥狀消失，試驗結束時解剖無心包炎、肝周炎、腹膜炎、氣囊炎等典型癥狀，取肝臟、心臟經麥康凱瓊脂培養無大腸桿菌生長，判為治愈。根據各組治愈動物數與該組動物總數，計算治愈率。
　　治愈率= 各組治愈動物數該組動物總數×100%（5）
　　1.2.7 數據統計與分析。
　　發病率、治愈率等數據以百分數表示，采用卡方檢驗對試驗數據進行分析;體重以平均值±標準差表示，組間用t檢驗進行比較;各組間顯著性用P值表示，其中0.01<P≤0.05表示差異顯著，P≤0.01表示差異極顯著。
　　2 結果與分析
　　2.1 人工感染雞大腸桿菌病模型建立的結果 攻毒后4 h，各攻毒組雞群均出現發病癥狀，發病率達100%，發病雞表現精神沉郁、被毛散亂、耷尾拖翅、飲食廢絕等雞大腸桿菌病的典型癥狀，健康對照組雞群在整個試驗期間未出現任何異常，判斷攻毒模型成立。試驗期間死亡雞只剖檢發現肝臟、心臟表面明顯的纖維素性滲出，病源分離結果顯示伊紅美藍培養基上出現典型大腸桿菌。根據活菌計數結果，選試驗中攻毒所用的菌液實際濃度為5.2×108 CFU/mL。
　　2.2 苦參功勞顆粒治療對病雞增重率的影響 將試驗前19日齡分組時稱取的雞只體重作為始重，試驗結束時即38日齡的體重作為末重，計算增重率，結果見表3。從表3可以看出，試驗開始時各組雞群初體重無顯著差異（P>0.05），試驗結束時攻毒各組平均體重極顯著低于健康對照組（P≤0.01），說明感染雞大腸桿菌后雞只增重減慢。但給藥各組試驗結束時末重均高于攻毒對照組;試驗期間增重率亦高于攻毒對照組。就試驗結束時末重而言，苦參功勞顆粒高劑量組顯著高于攻毒對照組（0.01<P≤0.05），中劑量組極顯著高于攻毒對照組（P≤0.01）;苦參功勞顆粒低劑量組、四黃止痢顆粒對照組與攻毒對照組間無顯著差異（P>0.05）。這說明苦參功勞顆粒按0.2、0.4 g/kg劑量使用在一定程度上可以改善雞群感染大腸桿菌所造成的生長發育受阻。
　　2.3 苦參功勞顆粒對病雞臨床癥狀的影響 根據癥狀計分結果，以第1、3、5、7、9、11、13、15和19天觀察癥狀百分率并繪圖，結果見圖1。
　　從圖1可以看出，第3天（即苦參功勞顆粒連續灌胃2 d），各組雞只的癥狀評分百分率均較高。第5天，由于雞群發病后雞只死亡，攻毒對照組癥狀評分百分率與第3天相比出現輕微下降。給藥各組由于給藥的影響，癥狀評分百分率急劇下降，攻毒后第7天已經降至相對較低的水平，攻毒第9天雞只完全痊愈，而攻毒對照組第13天癥狀才完全消失，癥狀評分百分率為0。這說明苦參功勞顆粒可以緩解大腸桿菌的發病癥狀，減輕發病程度，并能促進機體快速康復。
　　2.4 苦參功勞顆粒對人工感染雞大腸桿菌病治愈率和死亡率的影響 從表4可以看出，攻毒對照組死亡率為47.5%，給藥各組經過藥物治療后死亡率均有不同程度的降低。與攻毒對照組相比，苦參功勞顆粒低劑量組、四黃止痢顆粒對照組死亡率顯著降低（0.01<P≤0.05），苦參功勞顆粒中、高劑量組死亡率極顯著降低（P≤0.01）。苦參功勞顆粒低、中、高劑量組和四黃止痢顆粒對照組的治愈率分別為67.5%、77.5%、80.0%和72.5%，相對于攻毒對照組的自愈情況，各給藥組的治愈率極顯著高于攻毒對照組的自愈率（P≤0.01）。這說明雞只感染大腸桿菌病后，灌胃給予苦參功勞顆粒和四黃止痢顆粒可以降低雞只發病引起的死亡。 　　3 結論與討論
　?。?）大腸桿菌C83851新鮮培養物按5.2×108 CFU/mL的劑量胸肌注射0.2 mL可以成功建立雞大腸桿菌病模型，攻毒4 h后雞只出現典型的大腸桿菌病臨床癥狀，且通過剖檢和病原分離確認為大腸桿菌感染。試驗結束對病雞解剖發現，心包炎的發生率高于肝周炎，可能與大腸桿菌C83851株對對心臟的親嗜性強有關。該試驗建立的雞大腸桿菌感染模型的臨床癥狀與文獻[7-9]相一致。
　　（2）研究表明，中藥苦參提取物具有明顯的抗菌作用，對多種致病菌有效[10-11]。該研究中苦參功勞顆粒按0.1、0.2、0.4 g/kg體重灌胃給藥，連續5 d，可以明顯降低大腸桿菌感染雞只的死亡，3個劑量組的治愈率分別為67.5%、77.5%和80.0%。應用苦參功勞顆粒治療后能緩解發病癥狀，減輕發病程度，促使機體快速康復，體重增重率分別為56.91%、63.56%和61.36%，表明其對大腸桿菌病引起的雞只生長發育受阻具有改善作用。因此苦參功勞顆粒按推薦劑量0.2 g/kg（混飲，每升水加1.0 g）使用，連續5 d，對雞大腸桿菌病具有良好的治療作用。
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