昆蟲精氨酸激酶研究綜述

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　　摘要：治理農業害蟲及其抗藥性發展，探尋新的防蟲殺蟲靶標位點非常必要。精氨酸激酶是昆蟲能量代謝的關鍵酶，與飛行活動、識別寄主、消化食物和生長發育等密切相關，而且由于其只存在于無脊椎動物體內而成為熱點防蟲靶標位點。本文綜述了昆蟲體內精氨酸激酶的分子和晶體結構特點、分布規律與活性、環境因子影響、精氨酸激酶調節劑，及其在害蟲防治中的應用及前景。
　　關鍵詞：精氨酸激酶;結構特征;抑制劑;害蟲防治
　　中圖分類號：Q555.7     文獻標志碼：A     文章編號：1001-1463（2019）05-0069-06
　　Abstract：In order to control agricultural pests and pest resistance development， the exploring of new insecticidal target sites is importantly necessary. Arginine kinase is a key functional enzyme relate to energy metabolism of insects， flight activities， identifying host， digestion， the growth and development， etc， as well， because of its exist in invertebrates merely， Arginine kinase becomes a famous pest control target. Thus， This study summarized the arginine kinase molecular and crystal structure characteristics， distribution and activity and， influences of environmental factors， regulator of arginine kinase， application in pest control and the application prospect， so as to make a steppingstone to the future study and new pesticide development with arginine kinase.
　　Key words：Arginine Kinase;Sstructure traits;Inhibitors;Pest control
　　精氨酸激酶（Arginine Kinase，AK）廣泛存在于無脊椎動物體中，與肌酸激酶具有相似功能，是昆蟲體內唯一存在的磷酸源激 酶[1 ]，1935 年Lohmann[2 ]首次從蟹肌肉中分離獲得。不同來源的精氨酸激酶具有相同功能，即在胍基和ADP之間可逆的轉移一份子磷酸基團，緩沖ATP水平[3 ]。昆蟲體中，精氨酸激酶主要分布在代謝旺盛和能量需求大的組織中，催化如下反應：
　　L-arginine + Mg·ATP=N-phospho-L- arginine + Mg·ADP[4 ]
　　因此，精氨酸激酶活性和表達與昆蟲飛行活動、識別寄主和生長發育等諸多方面息息相關[5 - 6 ]。由于其不存在于脊椎動物中，因此可以作為農業害蟲防治中化學藥劑和生物藥劑新的靶標位點，通過抑制或干擾害蟲能量代謝，達到殺傷或殺死害蟲的目的?？梢?，深入研究并明確昆蟲精氨酸激酶特性及其抑制劑，不僅能為害蟲防治提供理論依據，而且對新型殺蟲劑的研發具有重要意義。我們綜述了精氨酸激酶結構與特性，精氨酸激酶基因表達規律，精氨酸激酶抑制劑及其在害蟲防治中的應用等方面的研究進展，以期為精氨酸激酶的進一步研究提供借鑒。
　　1   精氨酸激酶結構特征
　　1.1   分子結構特征
　　不同來源的精氨酸激酶結構有很大差 異[7 ]，主要結構形式為單亞基精氨酸激酶，其次為雙亞基和四亞基酶結構形式[8 ]，根據亞基不同，分子質量40～160 kD。精氨酸激酶由N端結構域和C端結構域組成[3，9 ]，兩個結構域中均具有高度保守的環狀結構，其活性部位位于C末端[10 - 11 ]。精氨酸激酶活性中心是一對離子對的高度保守氨基酸殘基。將蝗蟲（Locust）的精氨酸激酶的P272 氨基酸殘基誘導突變后，精氨酸激酶疏水殘基外露，因此學者猜測，活性位點附近的氨基酸殘基可能具有維持精氨酸激酶結構穩定和活性的作用[12 ]。
　　1.2   晶體結構特征
　　精氨酸激酶晶體主要為片狀晶體，長維為0. 1 mm 短維為0. 05 mm;也有四棱棒狀晶體，但四棱棒狀晶體在復合結晶中所占比例很小，三維為0. 1 mm×0. 02 mm×0. 02 mm。通過X射線衍射得到精氨酸激酶晶體的晶胞參數為 a = 14. 16 nm、 b = 5. 93 nm、c = 27. 12 nm、α=β=γ= 90. 0° ，表明該晶體屬于正交晶系，根據系統消光可知空間群為P212121。根據晶胞每不對稱單位內所含的蛋白質分子數目推算出，在精氨酸激酶復合物晶體中，每不對稱單位含有3個雙亞基精氨酸激酶分子[13 ]。
　　2   精氨酸激酶分布規律與活性
　　2.1   空間分布差異
　　研究表明，蝗蟲成蟲飛行肌精氨酸激酶活性顯著高于若蟲，與靜止狀態相比，成蟲飛行后飛行肌磷酸精氨酸含量降低[14 ]。在鱗翅目幼蟲中，腹足精氨酸激酶活性最     高[6，15 ]。通過計算ATP最大轉化率，發現厭氧肌肉中精氨酸激酶活性最高[16 ]，而蜜蜂精氨酸激酶在具有高能量需求的復眼組織中的表達水平最高，是頭部的2～3倍;其次為觸角，在卵巢中的表達水平最低[17 - 18 ]。由此可見，精氨酸激酶在昆蟲體中的空間分布與組織器官的能量需求相對應，能量需求越大，酶表達量越高，活性越強?；谝陨弦幝?，精氨酸激酶活性和基因表達受到抑制，必然不利于昆蟲的飛行活動[19 ]，并干擾昆蟲對外界環境因子和氣味等因子的識別。 　　2.2   時序分布差異
　　精氨酸激酶在昆蟲體中除了存在空間分布上的差異，還存在時序差異。鱗翅目幼蟲隨齡期增加，精氨酸激酶表達量增大[20 ]。在棉鈴蟲5齡幼蟲中腸中，精氨酸激酶水平隨日齡增加而逐漸升高，預蛹期達到最     高[15 ]。黑腹果蠅精氨酸激酶活性隨發育階段的變化規律與蛻皮激素保持一致，預蛹期達到高峰，蛹期下降，成蟲羽化期達到第二個高峰[21 ]。這種時序差異的例證有很多。呈現這種時序性的主要原因與組織和發育階段的能量代謝需求相關，能量需求越大，基因表達上調越高。因此，如果抑制或干擾害蟲精氨酸激酶基因表達，必然不利于昆蟲的生長發育，甚至使其致死[22 ]。
　　3   環境因子對精氨酸激酶的影響
　　精氨酸激酶是昆蟲能量代謝的關鍵酶，通過上調基因表達和酶活力參與昆蟲體對外界不良環境因子和逆境脅迫的抵御[23 ]，因此不同環境因子對精氨酸激酶的基因表達和酶活力的影響較大。過氧脅迫、缺氧、高溫和低溫等均能誘導精氨酸激酶基因表達量的增加，進而增加相對酶活力[4，24 - 25 ]。pH降低能引起精氨酸激酶的去折疊化，從而降低精氨酸激酶本身的活力，當pH呈中性時，精氨酸激酶也能夠通過恢復折疊而恢復酶活 力[26 ]。通過上調基因表達促使酶活力上升的持續時間相對較長，在環境因子恢復正常后，這種上調還會持續一段時間，但通過改變精氨酸激酶構象或三級結構而致使酶活力下降的現象會在不良環境因子解除后即恢復酶活力。
　　4   精氨酸激酶調節劑
　　精氨酸激酶是昆蟲體中能量代謝的關鍵酶，其酶活性和基因表達也可以被各類化學因子影響。對中華蜜蜂（Apis cerana）精氨酸激酶基因Acc AK研究發現，氯化鎘、吡丙醚、辛硫磷、百草枯、過氧化氫和維生素C等非生物脅迫因子分別處理15日齡成蟲，Acc AK基因的表達水平均顯著上調[27 ]。對精氨酸激酶及其底物復合物的結晶分析表明，該晶體具有較高內含水量[13 ]，而Cu2+可以使精氨酸激酶的疏水基暴露，從而抑制酶動力和分子動力[28 ]。黃酮類物質可以結合在精氨酸激酶的色氨酸周圍，因此對精氨酸激酶均有一定抑制效果[29 ]。比如蝗蟲體表接觸槲皮素和木犀草素6 d 后，其酶活力分別下降63.1%和23.5%，兩種化合物之間的抑制效率差異可能是由結構差異引起     的[30 ]。另外，楊梅素可以引起精氨酸激酶二級結構及其構象發生顯著改變，使α螺旋和β折疊明顯減少，最終使其疏水性減弱[29 ]。黃酮類化合物的母核二苯基色原酮是否也具有這種抑制作用目前尚不清楚。
　　與黃酮類物質具有類似抑制作用的化合物有硫氰酸根、硝酸根、硼酸根、亞硝酸根等一價陰離子，在體外條件下，它們能夠干擾精氨酸激酶中間產物MgADP-E-Arg的形成[24 ]，以NO3-對精氨酸激酶的抑制作用最強，抑制效率最高可達到92%。D-精氨酸和L-高精氨酸是精氨酸的類似物可以競爭性地結合底物，從而抑制精氨酸激酶活     性[24，30 - 31 ]。鹽酸胍濃度超過0.25 mol/L 時，精氨酸激酶的活性隨著鹽酸胍濃度的升高而降低，濃度達到0.8 mol/L后精氨酸激酶活性喪失。氧化應激反應可消耗大量的ATP并最終導致ATP耗竭[25，32 ]，因此對克氏錐蟲（Trypanosoma cruzi）用產生氧化脅迫的化合物H2O2和抗錐蟲藥硝呋噻氧處理后，其必須上調精氨酸激酶基因表達量才能克服逆境脅迫[33 ]。目前已經發現多種競爭與非競爭型精氨酸激酶抑制劑，本文不再贅述。
　　5   精氨酸激酶在害蟲防治中的應用
　　目前已注冊的殺蟲劑無不例外對靶向昆蟲以外的其它非靶向脊椎動物具有毒性，如鳥類、獸類、牲畜、魚類和人，而精氨酸激酶只存在于無脊椎動物中，以精氨酸激酶為靶標進行害蟲防治不會對其它脊椎動物造成不利影響[34 ]。因此，基于精氨酸激酶分子特點和結構功能，很多學者提出了精氨酸激酶抑制劑，例如可以使精氨酸激酶疏水基暴露，抑制酶動力的金屬離子;改變精氨酸激酶二級結構的植物次生代謝產物;能夠競爭性結合底物或干擾中間產物形成的化合物 等[28，30，33，35 - 36 ]。
　　近幾年隨著分子生物學的迅猛發展，以精氨酸激酶基因為靶標的RNA干擾（或RNA silencing， RNA沉默）技術得以實現[37 ]，雖然該技術尚處于探索階段，但已經為害蟲綜合治理開啟了新的篇章。Eduardo和Wayne通過植物內系統（In Plant System，IPS）飼喂技術向柑橘木虱（Diaphorina citri）飼喂100 ng （673 bp）特異性精氨酸雙鏈RNA （dsAK），進行精氨酸激酶基因轉錄敲除。飼喂6 d后引起柑橘木虱死亡，8 d時死亡率顯著高于對照，13 d時死亡率穩定在50%以上。Eduardo的補充研究表明，dsAK劑量的增加不會引起柑橘木虱死亡率的增加，在100 ng至10 μg的濃度梯度下最終累積死亡率為53% ～ 56%。于雪等[5 ]研究證明，利用重組質粒的菌液飼喂家蠅（Musca domestica）幼蟲，能將幼蟲精氨酸激酶基因敲低，菌液飼喂后第3天幼蟲開始死亡，至第6天幼蟲死亡率達到80%以上，而且存活的幼蟲發育歷期延長，體型變小?？梢姡彼峒っ缚梢猿蔀楹οx防治的新靶標位點。此類對精氨酸激酶RNA干擾的致死型研究在黃曲條跳甲（Phyllotreta striolata）[38 ]和棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）[20 ]等多種昆蟲上已得到驗證，針對害蟲的特有基因設計特異性藥物已經成為了害蟲生物防治的重要研究方向，而針對精氨酸激酶設計殺蟲劑，不會對其它脊椎動物的正常生長和發育產生影響，具有較高安全性，也為今后殺蟲劑的研發提供了新方向。 　　6   展望
　　長期使用廣譜性殺蟲劑所帶來的環境安全和害蟲抗藥性等問題已日益嚴峻，農業生產中亟需開發新的防蟲治蟲靶標位點，以促進安全高效的新型殺蟲劑的研發，從而保證農業經濟效益。精氨酸激酶由于只存在于無脊椎動物中而成為害蟲防治中化學藥劑和生物藥劑等的熱點靶標位點，通過抑制或干擾害蟲生物能代謝達到殺傷或殺死害蟲的目的。
　　隨著精氨酸激酶結構和功能研究不斷深入，具有強抑制作用的精氨酸激酶抑制劑的篩選和拓展對新型殺蟲劑開發具有廣闊的應用前景，而且以該酶為抑制靶標位點的新化合物正逐步被發現，例如黃酮類物質、高精氨酸類似物、胍類化合物、以及能引起精氨酸激酶構象變化的金屬離子和一些一價陰離子等。因此，深入研究并明確昆蟲精氨酸激酶特性，拓展昆蟲精氨酸激酶抑制劑種類，不僅能為農業害蟲防治提供新方向，而且對新型殺蟲劑的研發具有實際指導意義。
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　　收稿日期：2019 - 01 - 09
　　基金項目：甘肅省科技重大專項（1062NKDF021）;甘肅省科技支撐計劃項目（1604NKCA063）;蘭州市科技計劃項目（2016-3-95）;甘肅省農業科學院農業科技創新專項（2017GAAS23）。
　　作者簡介：魏玉紅（1976 — ），女，甘肅皋蘭人，高級農藝師，主要從事農業昆蟲與害蟲防治研究工作。
　　通信作者：張新瑞（1964 — ），男，甘肅武山人，研究員，博士，碩士生導師，研究方向為農業有害生物綜合防治。Email：zxr@gsagr.ac.cn。
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