納米細菌腎結石模型血、尿生化的動態觀測

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　　摘要：目的  構建納米細菌Wistar雄性大鼠腎結石模型，動態監測血、尿生化各項指標，旨在為進一步研究納米細菌在腎結石發生發展過程中所起的作用，提供數據支持，進而為腎結石病因學的下一步探索提供新思路。方法  將60只大鼠隨機分為納米細菌組和空白對照組，每組30只。納米細菌組給予尾靜脈注射1.2 ml NB懸液，空白對照組給予尾靜脈注射1.2 ml生理鹽水，實驗周期為10周，每周每組各處死大鼠3只，處死前采集大鼠血、尿標本，供生化分析，并取兩側鮮活腎臟標本，用于病理結晶情況檢測及計算腎體比。結果  自第8周開始，納米細菌組腎體比值大于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。截至第10周末，納米細菌組大鼠腎臟晶體陽性11只，空白對照組均為陰性，納米細菌組大鼠腎臟晶體陽性率高于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。與空白對照組相比，納米細菌組第4～8周血肌酐、第3～8周血尿酸、第3～9周尿素氮及尿鈣水平均升高，第8周納米細菌組尿pH高于空白對照組差，第6～7周納米細菌組血鈣高于空白對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論  腎體比、結晶陽性率、血肌酐、血尿酸、血尿素、尿鈣等重要指標的有效升高，均顯示納米細菌Wistar雄性大鼠腎結石實驗模型的成功制備，這為進一步揭示NB在結石形成過程中所起的作用以及后續對腎結石病因學的進一步研究提供了良好的實驗基礎與數據支持。
　　關鍵詞：腎結石;納米細菌;血、尿生化;腎功;大鼠腎結石模型
　　中圖分類號：R692.4;R322                             文獻標識碼：A                             DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.11.017
　　文章編號：1006-1959（2019）11-0058-06
　　Abstract：Objective  To construct a kidney model of nano-bacteria Wistar male rats， and to dynamically monitor blood and urine biochemical indicators， in order to further study the role of nanobacteria in the development of kidney stones， provide data support， and then the etiology of kidney stones. The next step is to explore new ideas. Methods  60 rats were randomly divided into a nanobacteria group and a blank control group， with 30 rats in each group. The nanobacterial group was given a 1.2 ml suspension of NB in the tail vein， and the blank control group was given a 1.2 ml saline solution in the tail vein. The experimental period was 10 weeks. Three rats died in each group per week. Blood and urine were collected before sacrifice. Specimens for biochemical analysis， and take fresh kidney specimens on both sides for pathological crystallization and calculation of renal to body ratio. Results  Since the 8th week， the renal body ratio of the nanobacterial group was larger than that of the blank control group，the difference was statistically significant （P<0.05）. By the end of the 10th week， there were 11 kidney crystals in the nano-bacterial group， and the blank control group was negative. The positive rate of renal crystal in the nano-bacterial group was higher than that in the blank control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Compared with the blank control group， the serum creatinine of the nanobacterial group was 4 to 8 weeks.At the 3rd to 8th week， blood uric acid and urea nitrogen and urinary calcium increased at the 3rd to 9th week. At the 8th week， the urine pH of the nanobacterial group was lower than that of the blank control group. The blood calcium level of the nanobacterial group was higher than that of the 6th to 7th week. The blank control group had significant differences （P<0.05）. Conclusion  The effective increase of renal body ratio， crystallization rate， serum creatinine， blood uric acid， blood urea， urinary calcium and other important indicators have shown the successful preparation of the experimental model of kidney calculus in nano-bacteria Wistar male rats， which further reveals NB. The role played by the formation of stones and the subsequent further study of the etiology of kidney stones provide a good experimental basis and data support. 　　Key words：Kidney stones;Nanobacteria;Blood，urine biochemistry;Kidney function;Rat kidney stone model
　　腎結石（kidney stones）是泌尿系結石的主要組成部分，是泌尿外科臨床診療中的常見病與多發病，腎結石病因復雜，涉及環境、飲食、代謝以及遺傳易感性等諸多方面。納米細菌（nanobacteria，NB）是芬蘭科學家Ciftcioglu N等[1]在哺乳動物細胞培養時發現的一種具有細胞毒作用且具有生物被膜的生物，隨著對納米細菌各項生物學特性的不斷了解，人們發現NB在泌尿系結石的發生發展過程中扮演著重要角色，NB所特有的生物礦化功能[2-6]在臨床許多鈣化性疾病中都得到了有效驗證，NB作為鈣化的核心[7-11]，并進一步促進了鈣化的發展。本研究立足于納米細菌Wistar雄性大鼠腎結石模型的建立之上，對其血、尿生化進行動態記錄分析，旨在為腎結石病因學的進一步研究，提供新的思路。
　　1材料與方法
　　1.1實驗動物  選取6周齡左右，體重（200±20） g，Wistar雄性大鼠60只，實驗動物均是來源于新疆醫科大學實驗動物中心的SPF級[合格證號SCXK（新）2013-0001;新醫動字SYXK（新）2010-0003]雄性大鼠，福利倫理審查證號：[2016]院倫審動實字（001）號（NO）A2016-001。將60只大鼠按隨機數字表法分為納米細菌組（NB組）和空白對照組（NC組）各30只，兩組大鼠均先于新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室適應性飼養1周，標準飼料喂養，飼料購自石河子大學實驗動物中心。
　　1.2實驗儀器與試劑  儀器：電子天平（江蘇常熟市大量儀器有限責任公司，LT1000B）、全自動生化分析儀（德國羅氏，Modual DPP）、多功能光學顯微鏡及圖像采集系統（日本Olympus，BX40）、透射電鏡（日本JEOL，JEOL-1230 Electronics）。試劑：納米細菌懸濁液（自制）、0.9%生理鹽水、蘇木素染液（石河子大學醫學院病理科贈）、伊紅染液（石河子大學醫學院病理科贈）、10%中性福爾馬林（石河子大學醫學院病理科贈）。
　　1.3模型建立及標本采集  納米細菌組給予尾靜脈注射1.2 ml NB懸液，空白對照組給予尾靜脈注射1.2 ml 0.9%生理鹽水，實驗周期為10周，每周每組各處死大鼠3只。記錄各組連續10周內飲食飲水、行為活動等情況，并實時測量記錄其體重變化。
　　1.4觀察指標
　　1.4.1 病理切片  處死前采集大鼠血、尿標本，供生化分析，并取兩側鮮活腎臟標本，供病理結晶情況檢測、計算腎體比。腎體比=（腎臟重量/體重×100%）。肉眼觀察腎臟的顏色及其大小改變。將標本制成石蠟病理切片，常規HE染色，在光學顯微鏡下觀察結晶的形成情況，按文獻提供的腎臟結晶分級（0～Ⅳ級）判定標準進行統計[12]。
　　1.4.2生化指標  使用全自動生化分析儀檢測肌酐，尿素，尿酸，尿鈣，血鈣，血鎂，血磷等生化指標，進行分析。
　　1.5統計學方法  實驗所得數據使用SPSS 22.0統計學軟件進行分析，計量資料數據用（x±s）表示，組間分析采用方差分析，組間比較采用t檢驗，組內比較采用SNK-q檢驗，顯著性水準α=0.05，P<0.05顯示差異有統計學意義。
　　2結果
　　2.1大鼠一般情況觀察  第1～2周，兩組大鼠表現無異，飲食飲水均正常，安靜溫順;第3～8周時，空白對照組大鼠進食良好、性情溫順，與前無異，納米細菌組大鼠逐漸變得煩躁不安、活動度明顯升高;至第9～10周，空白對照組仍然無明顯改變，納米細菌組表現為食欲減低，活動減少，精神倦怠。
　　2.2大鼠腎臟標本肉眼觀  動態觀察10周大鼠腎臟標本，肉眼可見空白對照組大鼠腎臟表面光滑，剖面呈現暗紅色，皮髓結構清晰，未見明顯斑點顆粒;納米細菌組從第4周開始，部分腎臟較空白對照組略有增大，剖面呈紅褐色，髓質呈淺紅色，皮髓結構清晰，腎盞及腎孟良好;第6周以后納米細菌組部分腎臟皮髓結構尚清晰，但有少量散在淡黃色顆粒沉積在腎組織中，觸之有沙礫感。肉眼觀，空白對照組無異常，納米細菌組可見黃色顆粒自腎盂向周圍，呈點狀分布。自第8周開始，納米細菌組腎體比值大于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。
　　2.3大鼠腎臟標本解剖顯微鏡觀察  解剖顯微鏡下可見，空白對照組大鼠腎臟內無晶體沉積，未見明顯病理改變。納米細菌組大鼠自第4周起，其腎臟病理切片可見灰白色晶體（見圖1）。10周計數，納米細菌組大鼠腎臟晶體陽性11只（陽性率52.38%），空白對照組均為陰性，見表2;截至第10周末，納米細菌組大鼠腎臟晶體陽性率高于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。因為納米細菌組大鼠在第4周開始成石，而前4周已處死的大鼠也存在成石的可能，所以在計算成石率時將前幾周已處死的大鼠排除在大鼠總計數之外。
　　2.4兩組血液生化比較  第1～8周，納米細菌組大鼠肌酐、尿酸、尿素均有不同程度的升高，第9～10周略有下降（見圖2）。納米細菌組與空白對照組比較，第6～7周血鈣、第4～8周肌酐、第3～8周尿酸、第3～9周尿素，差異均具有統計學意義（P<0.05），見表3;其余各周水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。納米細菌組血磷與血鎂與空白對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
　　2.5兩組大鼠尿液生化比較  兩組均可見第1～8周尿鈣水平有所提高，第9～10周，尿鈣稍下降（見圖3）。經檢驗，納米細菌組與空白對照組比較，第3～9周尿鈣與第8周尿pH值比較，差異均具有統計學意義（P<0.05），見表4，其余各周比較，差異無統計學意義（P>0.05）。24h尿量與尿比重分別比較，差異無統計學意義（P>0.05）。 　　3討論
　　生化檢測可反映機體諸多情況，血肌酐、血尿酸、血尿素等是檢查腎臟功能的重要指標，其測量值的改變直接反應機體腎臟功能的變化，本研究通過建立納米細菌Wistar雄性大鼠腎結石模型，對造模組與空白對照組分別進行干預，采集其血、尿標本進行動態監測分析，旨在為腎結石病因學的研究提供實驗支持。
　　本研究顯示，自第8周開始，納米細菌組腎體比值高于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;10周計數，納米細菌組大鼠腎臟晶體陽性11只（陽性率52.38%），空白對照組均為陰性，納米細菌組大鼠腎臟晶體陽性率高于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;納米細菌對大鼠腎臟形成損傷，最終導致腎結石的發生，繼而影響大鼠的性情及行為活動。
　　腎小管細胞損傷學說是腎結石發病機制的主要學說之一，腎小管細胞的損傷增加了結晶粘附和停滯的機率，促進了結石的形成[14，15]。國內外眾多學者通過[10]辛文虎，明星.腎小管上皮細胞損傷與草酸鈣腎結石形成機制的研究進展[J].國際泌尿系統雜志，2013，33（4）：539-542..
　　[11]粟宏偉，朱永生，鄧清富，等.上尿路結石患者血清、尿液、結石中納米細菌的檢測[J].重慶醫學，2013（31）：3754-3756.
　　[12]鄧耀良，陶芝偉，王翔.含鈣腎結石復發的危險因素及個體化防治策略[J].臨床泌尿外科雜志，2018，2（33）：85-88.
　　[13]Stefano GB，Challenger S，Kream RM.Hyperglycemia-associated alterations in cellular signaling and dysregulated mitochondrial bioenergetics in human metabolic disorders[J].Eur J Nutr，2016，2（2）：1-7.
　　[14]Nitin Abrol，Arabind Panda，Nitin S.Kekre，et al.Nanobacteria in the pathogenesis of urolithiasis：Myth or reality[J].Indian Journal of Urology Iju Journal of the Urological Society of India，2015，31（1）：3.
　　[15]van der Eerden BC，Koek WN，Roschger P.Lifelong challenge of calcium homeostasis in male mice lacking TRPV5 leads to changes in bone and calcium metabolism[J].Oncotarget，2016，1（1）：1-9.
　　[16]劉淼，谷江，董安濤，等.烏梅提取物對納米細菌致大鼠腎結石形成的影響及機制探討[J].山東醫藥，2017，57（14）：14-17.
　　[17]馬宏亮，楊彬，張雁鋼，等，納米細菌與感染和相關鈣化性疾病研究進展[J].山西醫科大學學報，2017，48（9）：963-965.
　　收稿日期：2018-12-2;修回日期：2019-2-25
　　編輯/肖婷婷
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