水產品中呋喃它酮代謝物AMOZ殘留的測定
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摘 要：為保證水產品質量安全，用酶聯免疫試劑盒檢測魚類水產品中呋喃它酮代謝物的殘留。檢測結果表明，AMOZ標準半對數曲線為Y=﹣22.34X+67.42，R2=0.9965，試劑盒在添加量為0.5、1.0、2.0μg/kg時，平均回收率分別為94.67%、106.67%、98.17%，除個別產品不符合規定外，絕大部分水產品未檢出AMOZ。酶聯免疫法適合對水產品中AMOZ的殘留做快速檢測。
關鍵詞：呋喃它酮;ELISA法;水產品
呋喃它酮（Furaltadone）是一種人工合成的硝基呋喃類廣譜抗生素，對多類細菌、真菌以及原蟲，都可以起到有效的抑制和滅殺效果，同時，使用呋喃它酮時，細菌很難產生耐藥性，并且與其他藥物一同使用時，也不會產生交叉耐藥性?；诖祟愃幬锼w現出的特點，已經在蜜蜂、畜禽、水產等養殖業得到了廣泛應用，可有效，同時還可以添加至飼料中，作為促生長劑使用。呋喃它酮對光具有較強的敏感性，將其作用于動物機體內后，其半衰期時間較短，一般為幾個小時，在對樣品進行檢測時，是無法發現原藥的。但是此種物質的代謝產物，會在動物組織內停留較長時間，與細胞膜上的蛋白質結合形成結合態可在體內殘留數周，甚至可傳給后代，并且當含代謝物的食品被人類食用后，在胃液的酸性條件下代謝物可從蛋白質中水解出來被人體吸收，因此在分析呋喃它酮的殘留時經常要分析其代謝后的產物。國內外研究表明，呋喃它酮具有嚴重的致癌、致畸、致突變等毒副作用。
基于呋喃它酮所表現出的危害性，歐盟組織于1995年開始，明確規定不得將其用于食用性動物中，在檢驗中禁止檢測出呋喃它酮，以避免對人體健康造成影響。同時，我國在2002年，農業部也做出了該方面的規定，在針對動物性食品進行檢驗時，不得檢測出呋喃它酮。然而，由于其具有高效、廉價等特點，在動物源性食品中，特別是水產品中檢出呋喃它酮代謝物的殘留案例仍有發生，針對這種現狀，如何通過更加簡便、高效、精準的方法，檢測出食用性動物體內的呋喃它酮，對加強食物安全監督就顯得尤為重要?，F階段，在檢測動物源性食品中呋喃它酮殘留時，一般需要先進行衍生處理，然后再采用高效液相色譜法、酶聯免疫法、膠體金免疫層析技術、液相色譜-串聯質譜法等手段，完成對呋喃它酮的檢測，確定是否含有此類物質。儀器分析法具有較高的準確性，可保證檢測結果的精準度，但也存在一定的局限性，所用設備成本較高，耗費的時間較長，檢測有效率較低，并且對操作人員專業性有著較高要求，在進行大規模篩選檢測時，不適合采用該方法。而酶聯免疫法具有較高的靈敏度，檢測成本較低、整個過程操作較為簡單，且特異性良好，在進行快速篩選檢測時有著較為理想的應用效果。本試驗主要使用酶聯免疫法快速檢測魚類水產品中呋喃它酮代謝物AMOZ的殘留。
一、檢測原理
測定的基礎是競爭性酶聯免疫反應，酶標板微孔條上包被有針對被測物抗體的抗體，加入標準品或樣品、酶標記物、被測物抗體溶液于板孔中，游離的被測物與酶標記物競爭抗體結合位點，同時被測物抗體也與微孔條上固定的抗體結合，洗去沒有結合的酶標記物，然后將發色劑加入到板孔中并孵育，結合的酶標記物可以將粉紅色的發色劑轉化為藍色產物，加入反應終止液后使顏色由藍色變為黃色，用酶標儀在450nm處測定吸光度，在一定濃度范圍內吸光度值與被測物濃度成反比，與標準曲線比較再乘以其對應稀釋倍數即可得出樣本中呋喃它酮代謝物的殘留量。
二、材料與儀器
1.主要儀器
MK3型酶標儀：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司;數顯電熱培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠;刀式研磨儀：RETSCH公司;PL602-L電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;3-18k型高速冷凍離心機：Sigma公司;多管漩渦混合儀：美國安勝科技有限公司;N-EVAP-24氮吹儀：美國Organomation公司。
2.試劑與溶液
呋喃它酮試劑盒：德國拜發集團;檢測下限為0.2μg/kg，包括：96孔酶標板、AMOZ標準品（0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ng/mL）、洗滌緩沖液（鹽）、抗體、酶標記物、基質/發色劑、反應終止液等。呋喃類組織前處理試劑盒：德國拜發集團;包括：1號試劑、2號試劑、3號試劑、4號試劑。正己烷：天津市富宇精細化工有限公司，乙酸乙酯：廣州化學試劑廠。
三、實驗步驟
1.樣品處理
魚去皮，取背部肌肉，用刀式研磨儀制成均質物。
2.樣品制備
?。?）稱取0.9g已均質的樣品于15mL離心管中，依次加入3.6mL蒸餾水、0.45mL1號試劑、108μL2號試劑。
?。?）振蕩混勻后，在50℃培養3h或者37℃恒溫培養16h。
?。?）分別加入4.5mL3號試劑、0.36mL4號試劑、4.5mL乙酸乙酯，渦旋震蕩30秒。
?。?）在室溫20-25℃下轉速4000rpm離心10分鐘。
?。?）取2.5mL上清液到一干凈離心管中，通過熱氮氣吹干（50-60℃水?。?。
?。?）加入1mL的正己烷到吹干的樣品管中溶解干燥物，加入1mL洗滌液，均勻混合。
?。?）室溫下轉速4000rpm離心10分鐘。
?。?）棄除上層有機溶液（如中間有乳化層，也一并棄除），每孔取出適量的下清液備用。
3.測定
（1）將呋喃它酮試劑盒從冰箱中拿出，回溫至室溫。
?。?）取出足夠數量的微孔條插入微孔架，各個標準液（0，0.1，0.3，0.9，2.7，8.1ppb）和每份待測樣品均做2個平行樣，并記錄標準品及樣品的位置。
?。?）加入50μL的標準品或處理好的樣品到各自的微孔中。
?。?）加入50μL酶標記物到微孔底部，用手將輕輕搖動微孔板混合。 ?。?）加入50μL抗體到微孔底部，輕敲微孔架四周，使其充分混合后于室溫（20-25℃）下避光靜置溫育60min。
（6）倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（至少拍打三次）以完全除去孔中的液體（如果有氣泡，可用吸耳球吹破），用多通道移液器向孔中加滿250μL洗滌緩沖液，再次倒出孔中的液體，完全除去孔中的液體，再重復操作洗滌步驟兩次以上。
?。?）加入100μL基質/發色試劑到微孔中，輕敲微孔架四周，使其充分混合。
（8）于室溫下避光靜置溫育15min。
?。?）于每一微孔中加入100μL反應終止液，用手將輕輕搖動微孔板混合。
?。?0）用酶標儀于波長450nm下進行吸光度測定。
4.數據處理
以標準品百分吸光度為縱坐標，標準品濃度對數值為橫坐標，繪制標準半對數曲線圖。將樣品的百分吸光度代入標準曲線中，從標準半對數曲線中讀出樣品所對應的濃度，乘以前處理時的稀釋倍數即為樣品中呋喃它酮代謝物的實際濃度。
四、結果
1.AMOZ標準曲線
根據AMOZ標準品的ELISA檢測結果繪制標準半對數曲線，見圖 1。
AMOZ標準半對數曲線從圖 1可知，標準曲線方程為Y=﹣22.34X+67.42，相關系數R2=0.9965。式中：Y為B/B0×100;X為樣品濃度的對數值。
2.回收率檢測
向0.9g生魚空白樣品中分別加入0.45、0.9、1.8ng的AMOZ標準樣品，每個濃度做3個平行，然后按照3.2和3.3的步驟進行前處理及檢測。實驗結果見表 1。
從表 1可以看出：呋喃它酮代謝物回收率在92.00%～113.00%，平均值為99.83%。
3.各魚樣的檢測結果
共檢測了18份水產品，各樣品的測定結果見表 2。
從表 2的結果中可以看出，鯇魚、鳊魚2個樣品都檢出了AMOZ殘留，測定結果分別為0.27、0.61μg/kg，其他樣品都未檢出。
五、結語
本試驗采用ELISA法對水產品中呋喃它酮代謝物的殘留狀況進行了檢測，結果表明絕大多數的樣品符合規定，只有極少數部分有檢出。
ELISA是酶標抗體與抗原進行的抗原-抗體反應。由于酶的專一性催化作用，酶標板上可同時檢測多份樣品，故操作簡易，靈敏度高，重現性好。本實驗的平均回收率在94.67%～106.67%之間，且在0.1～8.1ng/mL測量范圍內呈良好的線性關系，相關系數為0.9965。呋喃它酮代謝物含量與百分吸光度的線性方程為Y=﹣22.34X+67.42，因此ELISA非常適于大批量檢測水產品中AMOZ殘留含量。本方法作為一種快速篩選手段，配合精密儀器確證使用，在日常水產品大批量監測中有著十分廣闊的應用前景。
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