脫膠條件對鹽解絲素蛋白分子量的影響

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　　摘要    絲素蛋白分子量的大小是影響其應用范圍及應用價值的重要因素，控制其分子量對絲素蛋白產品的開發至關重要。本文采用堿脫膠法，以不同的脫膠溫度（100 ℃和80 ℃）制備2種脫膠蠶絲，以脫膠率來表征其脫膠程度，然后均用2種溶解溫度（60 ℃和75 ℃）和相同的溶解體系來溶解一定時間，觀察其溶解程度;對不同處理所得的絲素蛋白，采用SDS-PAGE4電泳方法觀察其分子量的分布情況，從而研究脫膠條件對鹽解絲素蛋白分子量的影響。結果表明，采用堿脫膠法，100 ℃脫膠蠶絲比80 ℃脫膠蠶絲的脫膠得率高;在相同的溶解液和溶解溫度下，100 ℃脫膠蠶絲溶解比80 ℃脫膠蠶絲快;相同條件的脫膠蠶絲在不同的溶解溫度下，溶解所得的絲素蛋白的分子量分布有所不同;而在相同溶解溫度下，不同的溶解時間對分子量分布的影響不大。
　　關鍵詞    家蠶絲;脫膠;絲素蛋白;分子量
　　中圖分類號    TS141.8        文獻標識碼    A        文章編號   1007-5739（2019）06-0211-03
　　蠶絲是一種天然蛋白質長絲，是傳統的服裝用纖維，由絲素及包覆在外的絲膠構成。隨著相關學科的交叉和發展以及人們對蠶絲結構與性能研究的不斷深入，絲素與絲膠因其蛋白特性和良好的生物相容性、可降解性而成為備受關注的功能材料，應用領域也由傳統的紡織服裝拓展到食品、化妝品、生物醫藥等領域[1-3]。這些研究的技術路線基本上都是將絲素（或絲膠）溶解（或降解）后制成某種成型物（例如粉體、膜材等）。因此，絲素與絲膠的分離成為相關研究中首先需要解決的問題。絲素與絲膠的分離原理是基于絲素不溶于水，而絲膠具有水溶性的特點，在一定作用條件下絲膠溶解，從絲素上脫除下來，從而達到分離的目的，這一過程稱為脫膠。常規的脫膠方法[4-6]，因所用的助劑不同，可分為酸脫膠、堿脫膠、酶脫膠、皂脫膠、高溫高壓脫膠及復合脫膠等，本文采用堿脫膠法。
　　由于絲素是高分子質量的蛋白質，蛋白分子量的大小是影響其應用范圍及應用價值的重要因素。因此，控制分子質量對絲素蛋白產品的開發至關重要[7-8]。本文采用SDS-PAGE電泳技術分析不同條件溶解體系制取的絲素蛋白的分子質量，探討調控絲素蛋白分子質量的方法。
　　1    材料與方法
　　1.1    試驗材料
　　1.1.1    材料。家蠶繭;透析袋（截留分子量8～14 kDa），由上海源葉生物科技有限公司生產。
　　1.1.2    試劑。脫膠及溶解所用試劑：無水碳酸鈉、無水氯化鈣、無水乙醇均為分析純。SDS-PAGE電泳所用試劑：丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、過硫酸銨、四甲基乙二胺、巰基乙醇、溴酚藍、甘油、冰乙酸、甲醇、考馬斯亮藍、甘氨酸等;標準蛋白Marker（分子質量在2～200 kDa，上海捷瑞生物工程有限公司）。
　　1.1.3    儀器與設備。移液槍、溫度計、離心管、AR2140（電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司）、HH-2（數顯恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司）、DGG-9070A（電熱恒溫鼓風干燥箱上海森信實驗儀器有限公司）、TG16-WS（高速離心機上海盧儀）、JY200C（電泳儀北京君意東方電泳設備有限公司）。
　　1.2    試驗方法
　　本文采用堿脫膠法，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術鑒定不同條件溶解體系的絲素蛋白分子量。
　　1.2.1    蠶繭的脫膠。100 ℃脫膠蠶絲制備：取10 g蠶繭，5 g無水碳酸鈉，投入1 000 mL沸水中，水浴45 min，撈出脫膠蠶絲，用等量（1 L）的蒸餾水清洗3～4遍，擰干，蓬松放入干燥箱中風干（45 ℃，過夜）。
　　80 ℃脫膠蠶絲制備：取10 g蠶繭，5 g無水碳酸鈉，1 000 mL水沸騰后冷卻至80 ℃再投入，水浴30 min，撈出脫膠蠶絲，用清水清洗3～4遍，再放原脫膠液中，水浴30 min，撈出，用蒸餾水清洗，擰干，蓬松放入干燥箱中風干（45 ℃，過夜）。
　　1.2.2    脫膠率的計算。計算公式如下：
　　D（%）=100×（W0-W）/W0
　　式中，D為脫膠率，W0、W分別為蠶繭脫膠前、后的干重。
　　干重的稱量條件：材料晾干后置于鼓風干燥箱中，在105 ℃下干燥，取出放入干燥平皿中冷卻至室溫后稱量。每種脫膠方案重復3次，取3次試驗結果的平均值。
　　1.2.3    絲素蛋白溶液物理現象的觀察。采用CaCl2-EtOH-H2O為溶解液[9-10]。在60 ℃溶解溫度下，5 g的100 ℃和80 ℃脫膠蠶絲，均置于盛有23 g 無水氯化鈣、23.8 mL無水乙醇及30 mL蒸餾水的錐形瓶中，溶解時間設置40、60、90 min 3個水平，觀察其物理現象并記錄。在75 ℃溶解溫度下，5 g的100 ℃和80 ℃脫膠蠶絲，均置于盛有23 g 無水氯化鈣、23.8 mL無水乙醇及30 mL蒸餾水的錐形瓶中，溶解時間設置40、60、90 min 3個水平，觀察其物理現象并記錄。絲素蛋白溶液物理現象觀察：將盛有已處理過的絲素蛋白溶液的玻璃容器，對光觀察其顏色，用溶液中是否含有顆粒狀來判斷其溶解程度。
　　將上述溶解后的液體，裝入透析袋中放置透析缸中進行透析，透析3 d，每天換1次水，除去其中的鹽和乙醇，最后利用分離技術將絲素蛋白與雜質分離，得到純化的絲素蛋白。 　　1.2.4    絲素蛋白分子量檢測。采用SDS-PAGE凝膠電泳方法[11]檢測。配制15%分離膠和5%濃縮膠。取12 μL樣品蛋白溶液于EP管內，加3 μL樣品緩沖液，加樣前在沸水中加熱3 min，再加入溴酚藍5 μL。采用JY-SCZ2+型直板電泳槽，每孔加樣量20 μL。用30 mA電流完成濃縮膠電泳過程，再把電流調至20 mA，完成分離膠電泳過程。電泳結束后用考馬斯亮藍染色，再用脫色液（冰乙酸100 mL、甲醇100 mL，加蒸餾水定容至1 000 mL）進行脫色。最后用掃描儀器拍膠。
　　2    結果與分析
　　2.1    不同處理溫度對蠶繭脫膠率的影響
　　從表1可看出，100 ℃脫膠蠶絲的脫膠率比80 ℃高。有文獻報道，脫膠率>30%說明蠶絲脫膠完全[4]。由此可見，在80 ℃溫度下進行的脫膠并不完全，其中脫膠蠶絲還殘留部分絲膠。因此，應根據不同的用途選擇不同的溫度和時間進行脫膠。
　　2.2    不同脫膠蠶絲在不同溫度溶解的物理現象
　　據文獻報道，絲素蛋白溶液是乳白色的，如果溶液呈淺黃色，說明其中的氨基酸被脫出來[4]。由表2可知，100 ℃下脫膠蠶絲就出現此現象，可能是由于脫膠溫度過高，導致蠶絲蛋白中的氨基酸脫出。因此，最后絲素蛋白溶液的顏色與脫膠的溫度和脫膠時間有關，與溶解溫度和溶解時間無關;而溶解程度與溶解溫度、溶解時間有關。也可得出，100 ℃脫膠蠶絲的溶解液分子量要小于80 ℃脫膠蠶絲的溶解液的。
　　從表2可以看出，相同的100 ℃溫度下脫膠蠶絲在60 ℃水浴條件下的完全溶解時間為90 min，而80 ℃的脫膠蠶絲要在75 ℃水浴溫度下，需要60 min才能溶解完全。100 ℃脫膠蠶絲和80 ℃脫膠蠶絲在相同溶解溫度下，100 ℃脫膠蠶絲比80 ℃脫膠蠶絲溶解所用的時間短，其原因是80 ℃脫膠絲還有殘留絲膠，導致其所需溶解時間長和溶解溫度高。因此，可以得出100 ℃脫膠蠶絲最佳溶解溫度為60 ℃，時間為90 min;80 ℃脫膠蠶絲最佳溶解溫度為75 ℃，時間為60 min。
　　2.3    不同條件溶解體系制取的絲素蛋白的分子量
　　采用SDS-PAGE凝膠電泳方法進行檢測。圖1～4中顏色較深的表示蛋白質聚集的較多，顏色較淺的表示蛋白質聚集的少。由圖1可知，100 ℃脫膠蠶絲在75 ℃水浴下溶解，分子量在15～31 kDa之間，隨著時間變化，對分子量大小的影響可忽略。
　　由圖2可知，100 ℃脫膠蠶絲在60 ℃水浴下溶解，分子量在31～51 kDa之間，隨著時間變化，對分子量大小的影響可忽略。
　　由圖3可知，80 ℃脫膠蠶絲在60 ℃水浴下溶解，分子量在51～79 kDa之間，隨著時間變化，對分子量大小的影響可忽略。
　　由圖4可知，80 ℃脫膠蠶絲在75 ℃水浴下溶解，分子量在51 kDa處，隨著時間變化，對分子量大小的影響變化可忽略。
　　從圖1～4可以看出，脫膠蠶絲在不同的水浴溫度下溶解，對分子量有影響，不論水浴溫度高低，80 ℃脫膠蠶絲分子量比100 ℃脫膠蠶絲高;脫膠蠶絲在相同水浴溫度、不同溶解時間下溶解，對分子量的影響可忽略。
　　3    結論與討論
　　本文探討了不同條件的脫膠蠶絲在脫膠時的優化條件及不同處理對絲素蛋白分子量的影響。試驗結果表明，在采用堿脫膠法下，100 ℃脫膠蠶絲脫膠得率比80 ℃脫膠蠶絲高。而在相同的溶解液和相同的溶解溫度下，100 ℃脫膠蠶絲比80 ℃脫膠蠶絲溶解快。100 ℃脫膠蠶絲溶解后，絲素蛋白溶液的顏色為淺黃色，80 ℃脫膠蠶絲溶解后，絲素蛋白溶液的顏色為乳白色。采用SDS-PAGE凝膠電泳測分子量，得出相同條件的脫膠蠶絲在不同的溶解溫度下，對分子量有影響（溶解所得的絲素蛋白的分子量有所不同）;而相同的溶解溫度下，不同的溶解時間對分子量的影響不大。
　　由于時間和試驗條件有限，本研究只是進行了初步試驗，還可在溶解液、溶解溫度梯度等方面進一步研究。蛋白分子量的大小是影響其應用范圍及應用價值的重要因素，因而控制分子量對絲素蛋白產品的開發至關重要。
　　4    參考文獻
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