肺炎支原體實驗室診斷的研究進展
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摘要：肺炎支原體（MP）是一種常見的呼吸系統感染病原體，約占兒童社區獲得性肺炎病例的40%。MP不僅引起肺部病變，也能侵犯心、腦、肝、腎等其他器官，引起多種肺外表現。然而MP感染臨床表現不具有特征性，臨床上亦缺乏早期有效的診斷方法，容易和其他病毒、細菌所致的呼吸道感染相混淆。目前MP的實驗室診斷方法不斷推陳出新，但各種方法均有其優勢與不足，本文對此作一簡要綜述。
關鍵詞：肺炎支原體;實驗室診斷;血清學診斷;基因學診斷
中圖分類號：R725.6 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.11.008
文章編號：1006-1959（2019）11-0026-03
Abstract：Mycoplasma pneumoniae （MP） is a common respiratory infection， accounting for approximately 40% of cases of childhood community acquired pneumonia. MP not only causes lung lesions， but also invades other organs such as heart， brain， liver， kidney， etc.， causing a variety of extrapulmonary manifestations. However， the clinical manifestations of MP infection are not characteristic， and there is a lack of early and effective diagnostic methods in clinical practice， which is easily confused with respiratory infections caused by other viruses and bacteria. At present， the laboratory diagnostic methods of MP are constantly being updated， but each method has its advantages and disadvantages. This paper gives a brief overview.
Key words：Mycoplasma pneumoniae;Laboratory diagnosis;Serological diagnosis;Genetic diagnosis
肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）是一種常見的呼吸系統感染病原體，是社區獲得性肺炎最主要的病原體之一，可通過飛沫或直接接觸感染，在兒童社區獲得性肺炎中有40%由MP引起，在成人獲得性肺炎中10.60%～25.82%由MP引起，在臥床患者中，其感染率更高，可達到29.4%。其可引起上呼吸道感染、支氣管炎、肺炎，也可引起嚴重的肺外并發癥[1]。近年來MP肺炎發病率有逐年增高趨勢，且難治性或重癥MP肺炎病例增多，給兒童、老人等免疫低下人群的健康帶來巨大威脅。MP感染臨床表現不具有特異性，易和其他病毒、細菌所致的呼吸道感染相混淆。由于MP缺乏細胞壁，使其對影響細胞壁合成的抗生素具有耐藥性，頭孢及青霉素類抗生素治療無效，因此應選擇抑制或影響蛋白質和核酸合成的藥物來治療，如大環內酯類、四環素類、氨基糖苷類、喹諾酮類。目前大環內酯類是首選藥物，喹諾酮類和四環素類不推薦用于兒童和孕婦臨床治療。隨著首選藥物廣泛應用，耐藥現象也日益嚴重[2]。因此，早期確診MP感染，及時、正確用藥，減少并預防耐藥性，具有重要的意義?，F對MP的主要實驗室診斷方法綜述如下。
1分離培養
MP分離培養包括液體培養法和固體培養法。液體培養法利用MP代謝產物使培養液中指示劑顏色發生改變（由紅變黃為陽性）而鑒定;固體培養法根據顯微鏡下菌落形態呈煎蛋樣進行鑒別[3]。傳統液固二步培養法曾是WHO推薦的診斷金標準，但MP自身無法合成甾醇，培養成本高，生長極緩慢，約2～4周，很難在臨床推廣。目前臨床上使用的快速液體培養法雖能在24～48 h完成診斷[4]，但培養基中加入的青霉素和醋酸鉈等物質無法抑制真菌和其他雜菌的生長，易產生假陽性。She RC等[5]對分離培養在MP感染的臨床診斷意義進行了評估，結果顯示與血清學和基因學檢測相比，分離培養法的靈敏度更低且耗時長，故此法不適于此類病原體的診斷。
2血清學檢測
雙份血清學抗體滴度升高4倍以上是診斷MP感染的金標準，但收樣困難、耗時，不利于臨床醫生及時制定治療方案。MP包括抗原檢測和抗體檢測，其中抗原檢測靈敏度低，易與呼吸道其他病原體出現交叉反應，臨床應用受限。MP侵入機體后，可引起免疫應答產生相應的抗體，IgM和IgG抗體一般分別在感染的1周和2周后開始出現，IgA抗體出現雖更早于IgM，但其靈敏度太低[1]。IgM在感染3～4周達到峰值，可做為急性期感染的診斷指標;IgG出現較晚，但持續時間長，一般用于判斷既往MP感染。IgM和IgG抗體同時檢測，有利于提高診斷率[6]。以下為幾種臨床常用的血清學檢測方法。 2.1補體結合試驗（CFA） 補體結合試驗在10余年前是檢測MP感染最常用的方法。MP感染后，MP抗原糖脂成分刺激機體產生特異性抗體?？乖贵w復合物和補體結合，在指示系統中能引起溶血;若血清中不含抗體，則補體不被結合，不發生溶血現象。但由于糖脂抗原并非MP的特異性抗原，與細菌、某些植物及人體組織可能有交叉反應，目前臨床不常用。
2.2血清冷凝集試驗（CAT） MP感染后，機體發生免疫應答，會產生一種非特異性IgM 冷凝集素。其在4℃下可使人的O型紅細胞或自身紅細胞發生凝集現象，而37℃溫浴后凝集現象消失。當滴度≥64時，對MP感染有參考價值。該方法操作簡單，但特異性較差，流感病毒感染、腺病毒感染、腫瘤等疾病也會導致CAT結果呈陽性，甚至抗生素的使用都會影響到CAT的結果[7]。
2.3酶聯免疫吸附試驗（ELISA） ELISA發明于1980年，常聯合檢測MP-IgM和MP-IgG以提高ELISA診斷率。原理是采用MP抗原包被于載體表面，捕獲血清中的相應抗體形成免疫復合物，再與酶標記的第二抗體結合，借助酶的降解作用顯示的顏色變化作出診斷[8]。該法僅需幾個小時，且與其他常見的呼吸道病原體無交叉反應，目前已有多個品牌的ELISA 試劑盒在售。其缺點是需用雙份不同時期的血清樣本對患者確診，且為多反應、多試劑、多步驟的檢測方法，其中被板溫育時間和溫箱的溫度、洗板次數、酶標儀的性能以及操作人員的熟練程度等多種因素均可影響檢測的結果，易產生假陽性。
2.4膠體金免疫層析法（CGIA） 基于雙抗夾心法，待測樣本中的MP抗體先后與膠體金標記的抗原和層析膜上固定的捕獲抗原結合，利用抗原抗體反應的特異性及膠體金的示蹤放大效應，對MP抗體實現目視化檢測[9];若層析膜上檢測帶區出現紅色變色反應，結果為“陽性”[10]。該方法的結果只報告陰性或陽性，不能報告滴度。無需特殊設備，5～10 min得到結果，適宜在一般基層醫院應用。由于其集合了免疫反應和色譜層析的優勢，溶血、脂血、黃疽對結果均無影響，但特異性靈敏度不高，易造成漏診[11]。
2.5顆粒凝集法（PA） 該法采用表面吸附MP抗原的明膠顆粒代替動物紅細胞做載體，致敏明膠顆粒與血清中的MP 抗體發生凝集反應。目前應用的PA試驗主要是利用乳膠和凝膠作為攜帶顆粒與試驗血清進行孵育。如果血清中含有MP特異抗體，顆粒附著，產生可見反應。該法可顯著消除血清冷凝集試驗中動物紅細胞的非特異性反應，凝集圖像清晰[12]。PA試驗應用混合MP抗原同時檢測IgG和IgM。國內MP的檢測主要采用進口試劑，如日本的PA（東京富士株式會社） 和美國EIA（GenBio公司）的MP抗體檢測試劑盒，便是基于此法設計，3 h可出診斷結果，但這些試劑價格昂貴且存在抗原特異性問題。
3基因學檢測
雖然MP血清學檢測簡便快捷，在臨床上得到了廣泛的應用。但這種方法僅對既往感染能提供較好的檢測指標，而對現癥感染考核的應用價值較低。臨床上推薦將血清學檢測和基因學檢測同時進行以提高診斷準確度[13，14]。目前MP基因學檢測的目標基因主要有三種：MP編碼P1黏附蛋白基因、16S rRNA 和延伸因子Tu基因設計。
3.1核酸雜交技術 該技術根據兩條互補的核酸單鏈可雜交結合成雙鏈的原理，針對MP目標基因設計用放射性核素或化學發光試劑標記的核苷酸片段，通過雜交，可探知受檢標本中有無與之互補的MP目的基因。美國GenProb公司的Gen-Prob rapid diagostic system診斷試劑，利用125I標記的cDNA探針，與MP特異的rRNA雜交，2 h內可完成檢測。該方法與其他支原體DNA無交叉反應，但敏感性差，但采用放射性核素標記，不便于臨床推廣。
3.2聚合酶鏈反應（PCR）技術 PCR技術是一種模擬體內DNA復制的體外擴增技術，上世紀80年代開始被用于檢測各種臨床標本中的MP。該法具有靈敏度高和快捷等優點，檢測標本中的MP不需要是活體，不受患者免疫功能、病程、感染程度和用藥情況的影響[15]，可早期診斷MP感染。依靠核酸擴增技術對肺炎支原體進行篩查已經在各國廣泛開展。PCR技術檢測病原體的核酸， 不存在交叉反應和放射性污染，大大提高了檢測的效率和靈敏性， 在臨床上的應用已十分廣泛。常用的PCR 法主要有常規PCR 法、巢式PCR[16]和實時熒光定量PCR（qPCR）[17]法等。而目前已報道的眾多PCR方法中，絕大多數需要對PCR產物進行純化、濃縮，這是一個即費時又費力的工作，很難滿足未來對自動化的要求。此外核酸擴增技術檢測過程中產生的假陽性污染也一直困擾著眾多研發人員。qPCR作為其中的代表，巧妙利用了PCR技術擴增的高效性，探針技術高特異性和光譜技術的敏感性及定量分析的優點，在完全閉管狀態下進行擴增和產物分析，克服了普通PCR易污染不能定量靈敏度不高等不足，目前已有多種基于此技術的MP試劑盒應用于臨床[1]，其檢測時間更短，敏感性更高，不再需凝膠電泳分析檢測結果[18]。但是也因其敏感性高，易使得MP定植時被誤診為感染。且存在熒光探針、儀器價格昂貴等問題[19]。
3.3環介導等溫擴增法（LAMP） LAMP技術是一種新的核酸擴增方法，針對MP靶基因上的6個區域設計4條引物，利用鏈置換型DNA聚合酶在恒溫條件下進行擴增反應，在65℃左右恒溫條件下對靶序列進行高效、高特異性的擴增，可在15～60 min內實現109～1010倍的擴增，反應能產生大量的擴增產物（焦磷酸鎂白色沉淀），可以通過肉眼觀察白色沉淀的有無來判斷MP靶基因是否存在[20]。不需進行模板熱變性、長時間溫度循環、繁瑣的電泳和紫外觀察等過程。LAMP方法最大優勢就是高靈敏度外，操作簡單，恒溫裝置就能實現反應，適合現場、基層快速檢測的方法[15]。但由于LAMP 擴增是鏈置換合成，靶序列長度最好在300 bp內，大于500 bp則較難擴增，故不能進行長鏈DNA 擴增，檢測對引物設計要求高。 4總結及展望
目前全球醫療決策中有2/3是基于診斷信息作出的，而診斷支出僅占醫療總支出的1%，診斷技術的進一步提高對疾病的預防、診斷和治療具有積極意義?；贛P檢測的龐大臨床需求，特別是在“精準化醫療”被提到國家戰略發展高度的社會大背景下，針對MP感染的實驗室診斷方法也在不斷更新發展，目前的MP檢測方法很多，各有優缺點，尚且無統一的診斷標準。MP檢測的方法主要有分離培養、血清學抗體檢測和PCR診斷。MP分離培養耗時較長，且培養條件苛刻，靈敏度不高，用于臨床診斷意義不大;目前臨床有兩類常用方法，一類是血清肺炎支原體抗體IgM（MP-IgM）檢測，一類是肺炎支原體核酸（MP-DNA）檢測。血清學檢測簡便快捷，在臨床上得到了廣泛的應用。但這種方法僅對既往感染能提供較好的檢測指標，而對現癥感染考核的應用價值較低。MP-DNA檢測則可以彌補血清MP-IgM檢測的不足，對于MP-DNA檢測，檢測標本中的MP不需要是活體，不受患者免疫功能、病程、感染程度和用藥情況的影響，可以更早期地檢測到MP的感染，有利于MP的早期診斷和抗生素的正確選擇。目前，臨床推薦在PCR法和血清學檢測中各選擇一種方法進行聯合檢測，盡快準確完成MP肺炎的診斷，以便及時、正確用藥，減少并預防耐藥性。
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收稿日期：2019-3-4;修回日期：2019-3-14
編輯/肖婷婷
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