脂聯素對體外循環心肌胰島素抵抗模型犬心肌腺苷酸活化蛋白激酶表達的影響

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　　摘 要 目的：探討脂聯素（APN）對體外循環（CPB）心肌胰島素抵抗（IR）模型犬心肌腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）表達的影響。方法：將24只犬隨機分為對照組、模型組、APN組（36 μg/kg）、AMPK抑制劑組（APN 36 μg/kg+AMPK抑制劑復合制劑C 0.5 mg/kg），每組6只。所有犬行CPB術，除對照組不給藥外，其余各組犬建立CPB心肌IR模型，并于主動脈夾閉后灌注不含藥或含相應藥物的St.Thomas心臟停搏液。分別在CPB轉流前和心缺血60 min后再灌注15、90 min收集冠狀靜脈竇血、頸動脈血，取左心室心尖部組織，測定并計算心肌葡萄糖攝取率和胰島素抵抗指數（IRI），監測心肌損傷指標[肌鈣蛋白T（cTnT）濃度]和心功能指標[左室收縮壓（LVSP）、左室內壓最大上升速率（+dp/dtmax）]變化，檢測磷酸化AMPK（p-AMPK）水平。結果：轉流前各組犬之間上述指標差異均無統計學意義（P>0.05）。與對照組比較，模型組犬再灌注15、90 min的心肌葡萄糖攝取率、LVSP、+dp/dtmax和p-AMPK水平均明顯降低（P<0.05），IRI和cTnT濃度均明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，APN組和AMPK抑制劑組犬再灌注15、90 min的心肌葡萄糖攝取率、LVSP、+dp/dtmax和p-AMPK水平均明顯升高（P<0.05），IRI和cTnT濃度均明顯降低（P<0.05），且APN組效果強于AMPK抑制劑組（P<0.05）。結論：APN可促進心肌對葡萄糖的攝取及代謝以助心功能恢復，其可能是通過增強AMPK活性來發揮效應的。
　　關鍵詞 脂聯素；體外循環；心肌胰島素抵抗；犬；腺苷酸活化蛋白激酶
　　Effects of Adiponectin on the Expression of Myocardial AMPK in Myocardial Insulin Resistance Model Dogs during Cardiopulmonary Bypass
　　ZHANG Dengshen，LIANG Guiyou，LIU Daxing，WANG Feng，PAN Sisi，ZHANG Changjiang（Dept. of Cardiovascular Surgery， the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University， Guizhou Zunyi 563000， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of adiponectin （APN） on the expression of myocardial AMPK in myocardial insulin resistance （IR） model dogs during cardiopulmonary bypass （CPB）. METHODS： Totally 24 dogs were randomly divided into control group， model group， APN group （36 μg/kg）， AMPK inhibition group （APN 36 μg/kg+AMPK inhibitor compound C 0.5 mg/kg）， with 6 dogs in each group. All dogs underwent CPB； except for control group without medicine， CPB myocardial IR model were established in other groups， and perfused with St.Thomas cardiac cardioplegia lipid no medicine or containing relevant drugs after main artery block. Coronary sinus blood and carotid artery blood samples were collected before bypass and after 15， 90 min reperfusion following 60 min myocardial ischemia. Left ventricular apical tissue was taken， and the uptake rate of myocardial glucose and insulin resistance index （IRI） were determined and calculated； the changes of myocardial injury indexes （cTnT concentration） and cardiac function indexes （LVSP， +dp/dtmax） were monitored. The level of p-AMPK was detected. RESULTS： There was no statistical significance in above indexes of dogs before bypass （P>0.05）. Compared with control group， the rate of myocardial glucose uptake， the levels of LVSP， +dp/dtmax and p-AMPK in model group were decreased significantly after 15， 90 min reperfusion （P<0.05）， and the concentrations of IRI and cTnT were increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the rate of myocardial glucose uptake， LVSP， +dp/dtmax and p-AMPK were increased significantly in APN group and AMPK inhibitor group （P<0.05）， while the concentrations of IRI and cTnT were decreased significantly （P<0.05）； moreover， the effect of APN group was better than that of AMPK inhibitor group （P<0.05）. CONCLUSIONS： APN can promote myocardial glucose uptake and metabolism， and contribute the recovery of cardiac function， the mechanism of which may be associated with increasing the activity of AMPK. 　　KEYWORDS Adiponectin； Cardiopulmonary bypass； Myocardial insulin resistance； Dog； AMPK
　　筆者前期研究發現，心肌胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）是體外循環（Cardiopulmonary bypass，CPB，又名心肺轉流術）心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的另一個重要機制[1-3]。心肌也是胰島素的靶組織，在CPB缺血再灌注過程中，不僅存在明顯的機體IR，同時也存在嚴重的心肌IR，因心肌IR的產生導致缺血再灌注心肌代謝紊亂，這可能是心功能障礙的病理生理基礎[4]，因此探尋心肌IR的干預靶點可為臨床防治MIRI提供新的途徑。
　　脂聯素（Adiponectin，APN）是脂肪組織分泌的一種活性多肽因子，具有與胰島素相似的作用，其結構類似于補體因子C1q，故也被稱為30 kDa的脂肪細胞補體相關蛋白。近年來研究發現，APN也可以由脂肪細胞外的其他細胞產生及表達，如心肌、骨骼肌細胞及肝臟[5-6]。目前大量研究提示，內源性刺激APN生成，或外源性補充APN，均可產生多種生物學效應，如胰島素增敏、免疫調節、抗炎、抗心肌細胞凋亡等作用，APN有望成為一種具有心肌保護作用的新型藥物[7-9]。APN可增加靶細胞對胰島素的敏感性，提高細胞對葡萄糖的利用而發揮降血糖的療效，其發揮上述藥效可能是通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）而實現[10-11]。故本研究建立了犬CPB 心肌IR模型[1-4]，予以心臟停搏液中加入APN，檢測了心肌AMPK活性變化，并通過特異性抑制AMPK活性，觀察了AMPK活性對心肌胰島素敏感性、心肌細胞葡萄糖攝取與心臟功能的影響，探討APN在CPB心肌保護作用中的可能機制。
　　1 材料
　　1.1 儀器
　　WEL1000型人工心肺機（天津江康醫用設備有限公司）；RY-II型呼吸機（江蘇凱泰設備有限公司）；MD3000型生物信號系統（北京鼠多寶生物科技有限公司）；TXT31型熱交換水箱（江蘇凱泰醫療設備有限公司）；AU2700型及5400型全自動生化分析儀（日本Olympus公司）；GC-2010型γ型放射免疫計數器（中國中供光電科大創新公司）。
　　1.2 藥品與試劑
　　人源重組APN（南京金瑞絲生物公司，批號：Q15848，純度：95%）；AMPK抑制劑復合制劑C（美國Selleck公司，批號：S784001，純度：99.8%）；戊巴比妥鈉對照品（美國Sigma 公司，批號：69020100，純度：99.3%）；兔源蘇氨酸（Thr）172位點磷酸化AMPK（p-AMPK）多克隆抗體（一抗，武漢博士德工程有限公司，批號：BM2103）；鼠源GTVsionTMⅢ抗鼠/兔通用型試劑盒（二抗，上海基因科技有限公司，批號：GK500705）；碘[I125]胰島素放射免疫分析藥盒（北方生物技術研究所，批號：121020）。
　　1.3 動物
　　24只實驗犬，8～12月齡，♀♂不限，體質量（10.12± 1.07） kg，體表面積（0.58±0.06） m2，由遵義醫學院動物實驗中心提供，使用許可證號為SYXK（黔）2011-003。實驗所涉及操作及動物處理符合動物實驗倫理審核標準，通過遵義醫學院動物倫理委員會允許。
　　2 方法
　　2.1 建模
　　按課題組前期研究方法氣管插管機械通氣（潮氣量12～15 mL/kg，頻率12～16 次/min），左股靜脈切開建立輸液通道，左頸總動脈、靜脈插管建立CPB，通過心臟灌注St.Thomas心臟停搏液，阻斷主動脈60 min及開放主動脈恢復心臟血流灌注，復制CPB心肌IR模型[1-4]，術中持續監測平均動脈壓（Map）（60～80 mmHg，1 mmHg=133.322 Pa）、肛溫、出入量，維持電解質及酸堿平衡，左心室經能量轉換器連接MD3000型生物信號系統。
　　2.2 分組與給藥
　　24只犬通過隨機數字法分為對照組、模型組、APN組和AMPK抑制劑組，每組6只。4組犬體質量及體表面積等資料差異均無統計學意義（P>0.05）。所有犬行CPB術，除對照組不建IR模型和不給藥外，其余各組犬復制CPB心肌IR模型，于主動脈阻斷時即刻灌注1次St.Thomas停搏液150 mL，模型組犬直接灌注St.Thomas停搏液，APN組的St.Thomas停搏液中按犬體質量加入36 μg/kg的APN[12]，AMPK抑制劑組的St.Thomas停搏液中按犬體質量加入36 μg/kg的APN和0.5 mg/kg的復合制劑C[13-14]。
　　2.3 標本采集
　　均于CPB轉流前和開放主動脈后15、90 min 這3個時間點，取冠狀靜脈竇血4 mL（“U”型插管采集[15]）， 3 000 r/min離心5 min，分離血清，用于檢測葡萄糖濃度和胰島素濃度；上述每個時間點另取頸動脈血2 mL， 3 000 r/min離心5 min，分離血清，用于檢測葡萄糖濃度；上述每個時間點用空心細針穿刺采集左心室心尖部心肌組織，采集的心肌予以生理鹽水沖洗2次，10%甲醛固定，72 h內石蠟固定，4 ℃保存，用于免疫組化檢測p- AMPK水平。
　　2.4 心肌葡萄糖攝取率的檢測
　　使用全自動生化分析儀，采用氧化酶法檢測每個時間點冠狀靜脈竇血清和動脈血清中葡萄糖濃度，計算心肌葡萄糖攝取率[心肌葡萄糖攝取率（%）=（動脈血葡萄糖濃度-冠狀靜脈竇血葡萄糖濃度）/動脈血葡萄糖濃度×100%][16]。
　　2.5 胰島素抵抗指數的檢測
　　按碘[I125]胰島素放射免疫分析藥盒說明書操作，采用放射免疫分析法，使用自動放射免疫計數器檢測冠狀靜脈竇血清中胰島素濃度，計算胰島素抵抗指數（Insulin resistance index，IRI），IRI=FIns/（22.5e-lnFBG），式中FIns 為冠狀靜脈竇血清胰島素濃度，FBG為冠狀靜脈竇血清葡萄糖濃度，常數e≈2.718[17]。 　　2.6 心肌損傷指標和心功能指標的監測
　　使用AU5400全自動生化分析儀采用比色法檢測每個時間點的冠狀靜脈竇血清中肌鈣蛋白T（cTnT）濃度，用于評價心肌損傷情況。通過犬左心室接能量轉換器連接MD3000型生物信號系統予左室內壓波形自動分析，測定每個時間點心臟左室收縮壓（LVSP）、左室內壓最大上升速率（+dp/dtmax），用于監測心功能。
　　2.7 心肌p-AMPK水平的檢測
　　取心尖部心肌組織，用10%甲醛固定，72 h內常規制作石蠟切片，石蠟切片4 ℃保存。常規脫蠟：60 ℃恒溫箱烘烤20 min，放入二甲苯Ⅰ15 min，二甲苯Ⅱ15 min。常規梯度乙醇水化，抗原6 min×2次修復，6%血清封閉60 min；滴加一抗（1 ∶ 100）50 ?L，4 ℃下保存18 h；滴加二抗50 ?L，37 ℃保存1 h；加入二氨基聯苯胺（DAB，1 ∶ 100）顯色，光鏡下觀察細胞核及胞漿為黃色、黃褐色為陽性顯色，在顯微鏡下控制染色時間和程度；水洗，蘇木精染色，再水洗，脫水，透明，封固，37 ℃烘烤30 min，Leica QWin V3圖像系統拍片，應用IPP 6.0圖象分析系統分析p-AMPK蛋白的積分光密度（IOD），取平均值作統計，IOD值越高，說明AMPK磷酸化程度越高。
　　2.8 統計學方法
　　數據以x±s表示，統計處理采用SPSS 19.0軟件進行。采用單因素方差分析不同時間點的數據并進行比較，方差齊時，采用LSD方法檢驗；方差不齊時，采用Games-Howell方法檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。
　　3 結果
　　3.1 心肌葡萄糖攝取率及IRI的變化
　　轉流前各組犬之間心肌葡萄糖攝取率和IRI差異均無統計學意義（P>0.05）。在心臟再灌注后，與對照組比較，其他3組犬心肌葡萄糖攝取率明顯降低（P<0.05）、IRI明顯升高（P<0.05），其中再灌注15 min時效果更明顯。與模型組比較，APN組犬再灌注15、90 min時的心肌葡萄糖攝取率均明顯增加（P<0.05），IRI明顯降低（P<0.05），表明APN可促進心肌葡萄糖攝取，減低心肌IR。與APN組比較，AMPK抑制劑組犬再灌注15、90 min時的心肌葡萄糖攝取率均有降低（P<0.05），IRI明顯升高（P<0.05）。各組犬心肌葡萄糖攝取率和IRI的測定結果見表1。
　　3.2 cTnT、LVSP、+dp/dtmax的變化
　　轉流前各組犬之間cTnT濃度、LVSP、+dp/dtmax差異均無統計學意義（P>0.05）。與對照組比較，其他3組犬再灌注15、90 min時靜脈竇血請中cTnT濃度明顯升高（P<0.05），LVSP、+dp/dtmax明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，APN組犬再灌注15、90 min時靜脈竇血清中cTnT明顯降低（P<0.05），LVSP、+dp/dtmax明顯升高（P<0.05）。與APN組比較，AMPK抑制劑組犬再灌注后靜脈竇血清中cTnT濃度明顯升高（P<0.05），LVSP、+dp/dtmax明顯降低（P<0.05）。各組犬靜脈竇血漿中cTnT濃度、LVSP、 +dp/dtmax的測定結果見表2。
　　3.3 心肌p-AMPK蛋白表達水平變化
　　轉流前各組犬之間p-AMPK蛋白表達水平差異均無統計學意義（P>0.05）。與對照組比較，其他3組犬再灌注15、90 min時心肌中p-AMPK蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，APN組犬再灌注15、90 min時心肌p-AMPK蛋白表達水平均明顯升高（P<0.05）。與APN組比較，AMPK抑制劑組犬再灌注15、90 min時心肌p-AMPK蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）。各組犬心肌p-AMPK蛋白表達水平的測定結果見表3。
　　4 討論
　　IR是細胞、組織與機體的一種病理狀態，因其靶組織對胰島素介導作用的抵抗而成為多種疾病（如高血壓、糖尿病、冠心病及肥胖等）發病的共同基礎。在CPB心臟手術過程中，手術創傷、低溫低壓、異物材料接觸等刺激因素可導致應激激素和介質大量釋放入血，機體與心肌細胞對胰島素敏感性降低，伴隨機體IR的同時，也存在嚴重的心肌IR，以心肌代謝障礙為主要表現，心肌對能量底物葡萄糖利用減少，而循環中血漿胰島素、葡萄糖明顯升高，其升高水平與心臟缺血時間呈正相關[1-4]。
　　有研究表明，AMPK是一種非常敏感的蛋白激酶，其α亞基的Thr172位點的AMPKα磷酸化是AMPK活化所必備的條件[18]。AMPK激酶在調節肝臟、骨骼肌、脂肪細胞等胰島素靶組織的葡萄糖轉運蛋白（Glut-4）表達及轉位有著重要的作用，AMPK的活化可以增加骨骼肌、肝臟及脂肪細胞膜Glut-4表達水平而促進葡萄糖攝取及轉運[19]。筆者在前期實驗中發現，通過增加AMPK表達及磷酸化，可促進心肌葡萄糖轉運及攝取，改善心肌IR，減輕MIRI[20]。已有臨床研究表明，APN水平降低與心血管疾病密切相關，冠心病、糖尿病等患者血漿中APN水平明顯低于健康人群[21]。心肌主要通過脂肪酸β氧化與葡萄糖有氧代謝兩條途徑獲取能量，而在缺血再灌注早期，促進心肌葡萄糖攝取及氧化可緩解損傷，因為脂肪酸氧化的氧耗明顯高于葡萄糖代謝[22]。心肌損傷后溶酶體破裂溶解細胞膜，心肌酶滲漏至外周血，可作為心肌損害標志物，其中cTnT敏感性及特異性均較高。由本實驗結果表明，心臟缺血再灌注后15 min，伴隨心肌對葡萄糖攝取的減少，冠狀靜脈竇cTnT持續升高，因為cTnT半衰期長，累積至再灌注90 min仍未減少，與此相對應，心臟LVSP、+dp/dtmax顯著下降，提示CPB心肌及心功能損害嚴重，通過補充APN，AMPK表達及磷酸化增加，心肌葡萄糖攝取率增加，緩解了心肌損傷；而特異性抑制AMPK活性，APN的上述功能也受到了抑制。本實驗結果提示，APN可增加AMPK活性，增加CPB心肌胰島素敏感性，促進心肌對葡萄糖的攝取，減輕MIRI。 　　參考文獻
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