改良型銀屑病小鼠模型的建立

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　　摘 要 目的：對咪喹莫特誘導建立小鼠銀屑病模型進行改良，建立銀屑病持續時間更長、特征更典型的銀屑病動物模型。方法：將小鼠隨機分為正常組（涂抹凡士林）、模型組[涂抹咪喹莫特乳膏60 mg/（2×3 cm2·d）]和改良組[涂抹咪喹莫特乳膏60 mg/（2×3 cm2·d）+皮下注射重組小鼠白細胞介素12（rmIL-12）和脂多糖（每周1次）]，連續21 d，每組10只。從造模第1天起每日觀察小鼠造模部位皮膚，對類似銀屑病樣皮損的紅斑、鱗屑、增厚等癥狀進行銀屑病面積與嚴重性指數（PASI）評分；造模21 d后處死小鼠，取皮損部位進行組織病理學檢查，計算脾指數，酶聯免疫吸附實驗（ELISA）法檢測皮膚中IL-17A、 IL-12的含量。結果：自給藥第3、2天起，模型組和改良組小鼠皮膚分別出現紅斑、鱗屑、增厚等類似銀屑病樣皮損，均在第12天PASI總分達到峰值；改良組從第11天起，小鼠皮膚紅斑、鱗屑、厚度較模型組更明顯，且連續9 d PASI總評分顯著高于模型組（P<0.05）；皮膚組織病理學觀察到模型組和改良組小鼠均出現Munro 微膿腫、棘層肥厚及真皮層炎癥細胞浸潤；與模型組比較，改良組小鼠脾指數更高（P<0.05）；與正常組比較，模型組和改良組小鼠皮膚中IL-17A、IL-12含量均升高，且改良組升高差異有統計學意義（P<0.05）。結論：建立的改良模型銀屑病典型特征維持時間更長。
　　關鍵詞 銀屑病模型；咪喹莫特；小鼠；銀屑病面積與嚴重性指數評分；白細胞介素12；白細胞介素17A
　　Establishment of Modified Model of Psoriasis Mice
　　XIU Yuanjuan，XIANG Cuiying，SHAO Zhenjun（Dept. of Research&Development， Huapont Pharm Co.， Ltd.， Chongqing 401121， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To establish psoriasis animal model with a longer duration and more typical psoriatic characteristics by modifying psoriasis model induced by imiquimod. METHODS： Mice were randomly divided into normal group （treated with vaseline）， model group [treated with Imiquimod cream 60 mg/（2×3 cm2·d）] and modified group [treated with Imiquimod cream 60 mg/（2×3 cm2·d）+subcutaneous injection of rmIL-12 and LPS once a week]， for consecutive 21 d， with 10 mice in each group. The skin of the model site was observed daily from the first day of modeling. Psoriasis area and severity index （PASI） score was conducted for skin lesions such as erythema， scales and thickening. 21 d after modeling， mice were sacrificed， and histopathological examination of the skin lesions was performed. The spleen index was calculated， and the contents of IL-17A and IL-12 in the skin were detected by ELISA. RESULTS： From the third and second day of medication， erythema， scales and thickening were both observed in model group and modified group respectively. The PASI score reached peak on the 12th day. From the 11th day， erythema， scales and thickening of the modified group were more serious than that in model group. PASI scores of modified group was significantly higher than that of model group for 9 consecutive days （P<0.05）. Histopathological observation showed that Munro microabscess， acanthosis and dermal inflammatory cell infiltration occurred in both model group and modified group. Compared with model group， spleen indexes of modified group were higher （P<0.05）. Compared with normal group， the contents of IL-17A and IL-12 in mice skin of model group and modified group were both increased， and there was statistical significance in modified group （P<0.05）. CONCLUSIONS： The estbalished modified model has the longer duration of typical characteristics of psoriasis. 　　KEYWORDS Psoriasis model； Imiquimod； Mice； Psoriasis area and severity index score； IL-12； IL-17A
　　銀屑病是一種常見并易復發的慢性炎癥性皮膚病，典型的臨床表現為皮損處紅色丘疹或斑塊，上覆厚層鱗屑，病理特征以皮膚角質形成細胞角化不全、角化過度、異常增生、血管形成和炎性細胞浸潤為主，嚴重影響患者的生活質量，目前的治療措施雖然有效，但并不能達到長期緩解的目的[1-2]。因此，銀屑病是當前皮膚科領域內重點研究的疾病之一，用于治療銀屑病的藥物是當前新藥開發的熱點。銀屑病動物模型是用于評價藥物療效的重要工具。目前用于研究銀屑病的模型有咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病模型、鼠尾鱗片模型、雌鼠陰道上皮模型、基因工程小鼠模型和異體移植模型等[3]，雖然模型眾多，但各有優缺點，目前并無可同時用于銀屑病發病機制、藥物療效和作用機制評價的理想的動物模型。咪喹莫特的臨床不良反應之一為誘導銀屑病發作[4-5]，利用咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病模型操作簡單、易于實現，且皮膚表型、病理特征具有組織間復雜相互作用并與臨床銀屑病類似的優點[6]，因此目前研究較多[7-9]，并普遍應用于藥物療效評價中；但該模型產生的炎癥持續時間較短，一般在1周左右達到皮損高峰后逐漸減輕，與人類銀屑病多數表現為遷延反復甚至終生不愈的慢性病程不相符[2，10]，癥狀的快速消退不利于藥物療效的評價，因此有必要進行改良使之達到較為穩定的狀態。由于活化的T細胞、樹突細胞和固有免疫系統細胞分泌的細胞因子可驅動銀屑病的發病[11]，因此本實驗擬在給予咪喹莫特乳膏涂抹之后，加用細胞因子白細胞介素12（IL-12）刺激小鼠免疫系統，以延長皮損持續時間，使銀屑病的特征更典型，以更好地用于銀屑病治療藥物的療效評價。
　　1 材料
　　1.1 儀器
　　ASP300自動脫水機、RM2215RTS石蠟切片機、EG1150 HC石蠟包埋機（德國Leica Biosystems Inc.）；BX41顯微鏡（日本Olympus公司）；Rayto RT-6100酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）。
　　1.2 藥品與試劑
　　咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業有限責任公司，批號：18030140，規格：3 g）；醫用凡士林（天津市大茂化學試劑廠，批號：20151210）；IL-12注射液（使用產品為重組小鼠白介素-12 p70 ，rmIL-12 p70，BD Pharmingen Inc，批號：6278771，規格：5 μg）；脂多糖（LPS）凍干粉（美國Sigma公司，批號：045M4087V，規格：10 mg）；IL-17A、IL-12酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒（上海將來實業股份有限公司，批號：JL20171、JL20166）。
　　1.3 動物
　　BALB/c小鼠，SPF級，♀♂各半，6～8周齡，體質量18～22 g，30只，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司。實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0002，實驗動物合格證號：11401500037928。小鼠飼養期間自由攝食飲水，控制環境溫度為18～24 ℃、相對濕度為40%～ 70%，明暗交替12 h。
　　2 方法
　　2.1 分組
　　小鼠適應性飼養后分為3組：正常組、模型組、改良組，每組10只。
　　2.2 模型建立
　　小鼠背部脫毛后，正常組每日在小鼠背部涂抹凡士林；模型組每日在小鼠背部涂抹咪喹莫特乳膏，60 mg/（2×3 cm2·d）；改良組在小鼠背部涂抹咪喹莫特乳膏的第1天起，每周1次皮下注射rmIL-12 10 ng（5 μL）和LPS 20 μg（5 μL）[12]。小鼠持續造模21 d。
　　2.3 檢測指標
　　2.3.1 皮損評分 參考臨床銀屑病面積與嚴重性指數（PASI）評分標準[13]，造模第1天開始，每日對皮損處紅斑、鱗屑、厚度按0～4評分，并將3項得分相加得到總分。PASI評分標準[14]：（1）紅斑。0分為無紅斑，1分為紅斑呈淡紅色，2分為紅斑呈紅色，3分為紅斑呈深紅色，4分為紅斑極深；（2）鱗屑。0分為表面無鱗屑，1分為部分皮損表面上覆有鱗屑，2分為大多數皮損表面覆蓋有鱗屑，3分為皮損部位幾乎全部被鱗屑覆蓋，鱗屑呈層，4分為皮損部位全部被鱗屑覆蓋；（3）厚度。0分為皮損與正常皮膚齊平，1分為皮損較正常皮膚表面稍高，2分為皮損中等度隆起，3分為皮損肥厚，隆起明顯，4分為皮損高度肥厚，明顯凸起。對各組總分取平均值繪制曲線。
　　2.3.2 皮損組織病理學觀察 于造模給藥第22天處死小鼠，并剪取背部部分皮損固定于10%甲醛緩沖液中，標本脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色。顯微鏡下觀察組織病理形態并照相。
　　2.3.3 脾指數 于造模給藥第22天小鼠稱體質量后處死并取脾稱質量，按以下公式計算脾指數：脾指數=脾質量（g）/體質量（g）。
　　2.3.4 皮膚中細胞因子含量測定 于造模給藥第22天處死小鼠，取0.1 g背部皮損皮膚加入1 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）后勻漿，以3 000 r/min離心20 min，取上清液檢測IL-17A、IL-12含量。具體操作步驟嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。
　　2.4 統計學方法
　　應用統計學軟件SPSS 16.0（SPSS Inc.）進行數據處理，計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析進行統計學分析。當P<0.05表示差異有統計學意義。
　　3 結果
　　3.1 小鼠皮損評分
　　與正常組比較，模型組和改良組小鼠分別從造模第3天和造模第2天開始陸續出現紅斑和鱗屑，皮膚增厚均在第7天觀察到；模型組小鼠紅斑PASI評分在第5天接近峰值，持續至第12天后開始下降；鱗屑PASI評分在第7天接近峰值，持續至第9天后開始下降，皮膚厚度在第11天PASI評分達峰后下降；改良組各觀察指標在前期與模型組表現相似，中期表現更為明顯，后期下降更緩慢。根據PASI總分，模型組和改良組均在造模第12天達到PASI總分峰值，造模第1～10天，模型組和改良組的PASI總分均數無明顯差異（P>0.05），但從第11天起，連續9 d改良組PASI總分高于模型組（P<0.05）。各組小鼠造模第13天時背部皮損肉眼觀察結果見圖1，不同時間點背部皮損 PASI評分結果圖2（注：正常組有2份標本在實驗中遺失，故n=8）。 　　3.2 小鼠皮膚組織病理
　　實驗結束時，正常組小鼠表皮層較薄，僅見1～2 層形態正常的細胞；模型組和改良組小鼠均出現表皮明顯增厚，部分位置的Munro微膿腫，棘層細胞數量增加，真皮層有大量炎癥細胞浸潤，與人類銀屑病皮損病理改變[1-2]基本相同。各組小鼠皮損的組織病理圖見圖3。
　　3.3 脾指數
　　實驗結束時，與正常組比較，模型組與改良組小鼠脾指數均升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與模型組比較，改良組小鼠脾指數升高，差異有統計學意義（P<0.05），詳見表1。
　　3.4 小鼠皮膚中細胞因子的含量
　　實驗結束時，與正常組比較，模型組和改良組小鼠皮膚中IL-17A和IL-12的含量均升高，但僅改良組的升高差異有統計學意義（P<0.05），詳見圖4。
　　4 討論
　　近年來的研究認為，銀屑病的發病與IL-23/T hellper cell（Th）17軸和Th1/Th2平衡有關，且細胞因子[IL-17、IL-12、IL-1、腫瘤壞死因子（TNF）-α等]之間的相互作用可以解釋銀屑病的大多數臨床特征，如角質形成細胞的過度增殖、新生血管和炎癥的增加[11]。咪喹莫特可激活真皮樹突細胞分泌產生IL-23，后者與Th17細胞上的IL-23受體結合，激活信號傳導及轉錄活化因子3（STAT3）分子引起IL-17A表達上調，激活角質細胞上的IL-17A和IL-17R同源二聚體而誘導核轉錄因子κB（NF-κB）信號活化產生炎癥反應[15]。IL-17A是驅動銀屑病發病的已知的6種IL-17亞型中最重要的一種，是活化的記憶性T細胞的產物，可刺激角質細胞產生抗菌肽、促炎癥細胞因子及趨化因子，利于樹突細胞和T細胞在皮膚募集[16-18]。目前已研發出多種IL-17A拮抗藥，如蘇金單抗、Ixekizumab，已用于治療中、重度斑塊型銀屑病[19]。樹突細胞生成的IL-12與T細胞上的IL-12受體結合后能促進分化的CD4+的Th1增殖，導致Th1/Th2平衡紊亂，引起銀屑病的發生[20-21]。有研究表明，銀屑病患者體內的IL-12水平顯著高于健康人IL-12的水平[22]。LPS可直接刺激TNF-α、IL-6，并在較小程度上刺激小鼠皮膚來源的樹突細胞產生IL-12，可能涉及自身反應性T細胞的促炎狀態[12]。鑒于咪喹莫特與IL-12各自對IL-23/Th17軸和Th1/Th2平衡的影響，采用咪喹莫特聯合IL-12及LPS，既能刺激小鼠的IL-23/Th17軸，又能影響Th1/Th2平衡，更符合銀屑病復雜的發病機制，達到改良模型的目的。
　　本研究希望通過改進咪喹莫特誘導的銀屑病動物模型，達到模型更持久、特征更典型的目的，從而有利于銀屑病治療藥物的療效評價。目前臨床上銀屑病嚴重程度指標主要為PASI評分[23-24]，銀屑病動物模型多用PASI評分結合病理作為判斷標準，因此肉眼觀察結果和PASI評分為模型建立的主要評價指標。目前許多文獻[7-9]已開展了咪喹莫特誘導的銀屑病模型機制的研究，本研究在機制方面僅選擇了有代表性的、與造模劑相關的指標。IL-17A和IL-12分別為IL-23/Th17軸和Th1/Th2平衡這兩條銀屑病致病途徑中的重要細胞因子，且目前也有許多靶向這兩種細胞因子的生物制劑用于治療銀屑病[25]。鑒于細胞因子水平的改變可間接反映皮損的變化趨勢，因此本實驗僅選擇IL-17A和IL-12這兩個細胞因子用于反映改良組的效果。
　　在已有的咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病常規模型中，皮損在5～8 d達到峰值后，皮損會逐漸消退[26-28]，皮損中的IL-17A mRNA的水平也呈先升高后明顯降低的動態變化過程[29]。在本實驗中，改良組BALB/c小鼠每日涂抹咪喹莫特乳膏后每周皮下注射IL-12和LPS，造模周期延長至21 d，該操作方法目前尚未見文獻報道。在本實驗中，銀屑病模型在達到皮損峰值后，模型組與改良組皮損均開始消退，但改良組小鼠皮損的消退較慢，皮損程度也較為嚴重。皮損的組織病理檢查仍可見典型的銀屑病樣改變。改良組小鼠脾指數明顯高于模型組，提示改良方法可引起小鼠免疫系統亢進加重。模型組小鼠皮損中的IL-17A和IL-12的含量雖然較正常組稍高，但差異已無統計學意義，但改良組小鼠的IL-17A和IL-12含量仍處于較高水平，較正常組差異仍有統計學意義。
　　本研究從肉眼觀察、PASI評分、臟器指數和細胞因子幾個方面進行評價，結果均表明改良組造模效果優于模型組。綜上所述，改良的小鼠銀屑病典型特征維持時間更長，是一種效果較好的模型。
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