藥品控制菌檢查法中大腸埃希菌貯藏方法的研究
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摘 要：大腸埃希菌在4°中貯藏，其作為實驗菌的活性。連續31天進行大腸埃希菌計數和特征實驗，進而驗證其數量及性狀的穩定性。結果表明，在連續31天的實驗中，大腸埃希菌的菌落數范圍在1.5×109cfu/ml～8.7×109cfu/ml，且菌落大小、形態特征、指示反應等情況均體現出該菌種應有特性。實驗證明，在4°冰柜貯藏條件下，大腸埃希菌能夠作為對照菌進行控制菌檢查法實驗。
關鍵詞：大腸埃希菌;貯藏;研究
中圖分類號：R927 文獻標志碼：A 文章編號：2095-2945（2019）11-0175-02
Abstract： Escherichia coli（E. coli） was stored at 4° as an experimental bacterium. The counting and characterization experiments of E. coli were carried out for 31 consecutive days to verify the stability of its quantity and character. The results showed that the colony number of Escherichia coli ranged from 1.5×109cfu/ml to 8.7×109cfu/ml for 31 consecutive days， and the colony size， morphological characteristics and indicative reactions all reflected the proper characteristics of the strain. The results showed that E. coli could be used as control bacteria in the control bacteria test under 4° storage condition.
Keywords： Escherichia coli （E. coli）; storage; study
依據《中華人民共和國藥典》2015版，非無菌產品微生物限度檢查中的控制菌檢查法，需進行陽性對照試驗，每次試驗均需要加入不大于100cfu的對照菌[1]。依據藥典指導原則，菌種可采用低溫冷凍干燥、液氮貯存、超低溫冷凍（低于-30℃）等保存方法。使用以上方法保存菌種，則需在每次實驗前都要進行菌種活化和計數實驗，進而配制不大于100cfu的加菌量。本公司藥品均進行微生物限度檢查，其中含有大腸埃希菌項目。為提高檢驗效率，尋找適宜的菌種貯藏方法，同時結合本實驗室實際情況，將大腸埃希菌經復蘇后接種至胰酪大豆胨液體培養基中，24h菌種活化后，4°C冰柜里貯藏。隨后每日進行菌種數量及性狀驗證，為進行大腸埃希菌的貯藏提供有益的科學探討。
1 材料與方法
1.1 儀器與材料
BPX-272 型電熱恒溫培養箱由上海博迅醫療設備廠生產;YSQ-LS-75SII型立式壓力蒸汽滅菌器由上海博迅醫療設備廠生產;1300系列A2型生物安全柜由賽默飛生產;大腸埃希菌[CMCC（B）44102]購自中國食品藥品檢定研究院;實驗所用培養基購自北京奧博星生物技術有限責任公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 菌液制備：復蘇后的大腸埃希菌菌種（不超過5代）移至胰酪大豆胨液體培養基置培養箱中30～35°C培養24h，培養后貯藏至4°C冰柜。
1.2.2 菌種計數：取1ml菌液用pH7.0蛋白胨緩沖液逐級稀釋至10-10，取各級稀釋菌懸液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15～20ml溫度不超過45°C熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻，凝固，倒置培養。30～35°C培養24h，然后計數。
1.2.3 性狀驗證：10-8稀釋級菌液大腸埃希菌接種于麥康凱液體培養基（42～44°C培養24h）和麥康凱瓊脂培養基（30～35°C培養24h）中，觀察培養基上大腸埃希菌生長情況。
2 實驗結果
2.1 菌種計數實驗結果
由表1可以看出，大腸埃希菌在4°C冰柜里貯藏，連續31天的菌落數范圍在1.5×109cfu/ml～8.7×109cfu/ml之間。
2.2 性狀驗證實驗結果
由表2可以看出，大腸埃希菌在4°C冰柜里貯藏，連續31天取菌液量均不大于100cfu，加入麥康凱液體培養基和麥康凱瓊脂培養基中，培養基體現的菌落大小、形態特征、指示反應等情況均體現出大腸埃希菌應有特性（+表示）。
綜上，將大腸埃希菌在4°C冰柜里貯藏，連續31天進行計數和性狀實驗。結果表明，取10-8稀釋級菌液，每ml菌液量均不大于100cfu，這可用于大腸埃希菌檢測陽性對照試驗的加菌量，無需每次進行驗證。同時，每ml10-8稀釋級菌液也能夠表現出大腸埃希菌應有特性。由此證明，每次進行大腸埃希菌實驗，可直接用貯藏菌液稀釋至10-8，取1ml作為陽性對照實驗的加菌量。
3 討論
藥品微生物限度檢查是控制藥品質量的一個重要檢查項目，其中控制菌檢查是必須進行的檢驗項目?？刂凭鷻z查過程中，需要添加不大于100cfu陽性菌進行陽性對照實驗。按照冷凍法活化新鮮菌種，進而制備試驗菌，其工作量較大，周期較長?，F采用4°C冰柜貯藏大腸埃希菌菌液，每次可以直接進行稀釋使用，提高工作效率，同時也可保障檢驗的順利進行。本文只對大腸埃希菌進行實驗，其他菌種（銅綠假單胞菌、沙門菌等）未進行相關實驗，故是否能應用于所有控制菌實驗還需進一步研究。
參考文獻：
[1]中華人民共和國藥典（四部）[M].2015.
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