綿羊卵母細胞成熟培養的研究進展

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　　摘要：卵母細胞培養是胚胎工程的重要組成部分，是體外受精、胚胎移植及轉基因技術的基礎。不斷完善卵母細胞成熟培養條件，可以大大提高卵母細胞體外成熟的質量，充分發揮綿羊卵母細胞的繁殖潛力。綿羊卵母細胞體外成熟培養受到多種因素的限制，其中培養液成分包括基礎培養基、血清、激素、卵泡液、生長因子、抗氧化物和維生素等6個方面。筆者對綿羊卵母細胞成熟培養的培養液成分相關研究進展進行綜述，旨在提高綿羊卵母細胞體外成熟培養的質量和促進體外胚胎技術研究。
　　關鍵詞：綿羊;卵母細胞;成熟培養;研究進展;培養液成分
　　中圖分類號： S826.3  文獻標志碼： A  文章編號：1002-1302（2019）10-0022-04
　　卵母細胞體外成熟（in vitro maturation，簡稱IVM）是指從卵巢卵泡腔中采集未成熟的卵丘-卵母細胞復合體（cumulus-oocyte complexes，簡稱COCs），在體外成熟培養液中，經過成熟培養后，排出第一極體的過程[1]。卵母細胞的體外成熟、體外受精（in vitro fertilization，簡稱IVF）、胚胎移植技術（embryo transfer，簡稱ET）及轉基因技術（cloning and gene transfer）在提高母畜繁殖力、加快品種改良、縮短世代間隔等繁殖相關領域具有廣泛的應用前景[2]。卵母細胞體外成熟培養的品質是決定動物體外人工輔助生殖技術成敗的關鍵因素之一。研究表明，卵母細胞體外成熟是一個復雜的過程，除了內源性激素（卵泡刺激素、促黃體素和雌二醇）的表達調控之外[3]，成熟培養液中外源性的分子也是影響卵母細胞成熟發育的重要因素[4]。Wei等研究發現，在體外成熟培養過程中，馬絨毛膜促性腺激素（equine chorionic gonadotropin，簡稱eCG）提高了綿羊卵母細胞的成熟率，減少了卵母細胞的凋亡，并增強了卵泡刺激素受體（follicle-stimulating hormone receptor，簡稱FSHR）、促黃體素受體（luteinizing hormone receptor，簡稱LHR）和促性腺激素釋放激素受體（gonadotropin-releasing hormone receptor，簡稱GnRHR）的表達，從而促進卵母細胞體外成熟培養[5]。Anchordoquy等研究發現，將血管內皮生長因子在培養0～3 h和半胱胺在培養4～24 h時連續加入成熟培養液中，提高了牛卵母細胞質的成熟質量和體外培養的效率，促進了牛卵母細胞的發育能力;當卵母細胞在同時含有血管內皮生長因子和半胱胺的卵母細胞成熟液中培養24 h后，雖然提高了牛卵母細胞中谷胱甘肽（GSH，具有清除代謝過程中產生的自由基的作用，防止胚胎因過氧化作用而導致早衰）的含量，但對胚胎發育具有不利影響[6]。卵母細胞的體外成熟受多方面因素的作用，如季節、年齡、卵母細胞的來源、培養液成分等諸多要素。雖然關于綿羊卵母細胞體外培養的報道較多，但是與體內卵母細胞正常成熟相比，卵母細胞的體外成熟還存在一些問題，比如質量較差、受精率較低、早期胚胎發育停滯等。因此，如何提高綿羊卵母細胞體外培養的質量成為促進體外胚胎技術的關鍵之一。本研究就綿羊卵母細胞體外成熟培養的培養液成分進行綜述，旨在為提高綿羊卵母細胞體外培養的質量及其在動物人工輔助生殖領域的廣泛應用提供理論參考。
　　1 基礎培養液對綿羊卵母細胞體外成熟培養的影響
　　目前，國內外研究者多選擇合成輸卵管液（synthetic oviduct fluid，簡稱SOF）和TCM199（tissue culture medium 199）作為基礎培養液進行綿羊卵母細胞體外成熟培養，為卵母細胞的成熟提供營養因子，成熟率可達79%[7]。SOF是一種成分簡單的培養液，常應用于早期胚胎的培養，主要由幾種常規的無機鹽類和能量底物組成，如乳酸、丙酮酸鈉、葡萄糖，使用時須要同時添加氨基酸。TCM199是一種成分復雜的培養液，除了含有幾種常規的無機鹽類和能量底物外，還含有維生素、嘌呤、核苷酸及微量表面活性劑等成分[8-9]。體外受精后的胚胎培養需要添加卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，簡稱FSH）和促黃體素（luteinizing hormone，簡稱LH）。目前，綿羊卵母細胞體外成熟體系中以TCM199應用較為廣泛[10]。此外，為了提高綿羊卵母細胞體外培養的成熟率，通常還要在基礎培養液中添加血清、激素、卵泡液、生長因子、抗氧化物等。
　　2 血清對綿羊卵母細胞體外成熟培養的影響
　　血清對哺乳動物卵母細胞的成熟具有一定的促進作用，它含有卵母細胞生長所需的多種氨基酸、維生素、激素、生長因子和抗氧化物質等。在卵母細胞成熟液中添加血清，能為顆粒細胞提供營養成分，防止卵母細胞卵黃膜硬化，保持卵母細胞的完整性，促進卵母細胞成熟。目前常用于卵母細胞成熟培養液中的血清有胎牛血清（fetal bovine serum，簡稱FBS）、新生牛血清、發情牛血清和牛血清白蛋白。研究表明，由于胎牛還未與外界接觸，胎牛血清中含有抗體、補體等，對細胞有害的成分最少，所以胎牛血清優于牛血清白蛋白;由于發情牛血清中含有一定濃度的激素和促成熟因子，能促進卵母細胞的成熟，所以發情牛血清優于胎牛血清[11]。有研究發現，在卵母細胞成熟液中添加10% FBS和20% FBS，并補充以丙酮酸、谷氨酰胺、促黃體素、促卵泡素和雌二醇（E2），在卵母細胞成熟率方面沒有顯著差異（82%與79%）;但是，在含有20% FBS培養液中發育成熟的卵母細胞受精后，繼續用含有20% FBS的發育液培養時，其卵裂率顯著高于其他試驗組，發育至桑椹胚、囊胚期的早期胚胎數也高于其他組[10]。
　　3 激素對綿羊卵母細胞體外成熟培養的影響
　　卵母細胞成熟液中常添加的激素有FSH、LH和E2。FSH和LH是參與卵泡發生最主要的蛋白質激素，與顆粒細胞、內膜細胞上的受體結合并激活環腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，簡稱cAMP）系統，導致類固醇激素的合成，尤其是雌二醇的合成，從而促進卵泡的卵母細胞發育和排卵。FSH促進卵泡的發育，在生長期的大部分時間內，卵母細胞停滯在前Ⅰ期，需要LH刺激形成排卵峰，導致顆粒細胞中cAMP的含量上升，卵母細胞中cAMP含量下降，減數分裂重啟[11]。在成熟培養液中添加適當濃度的LH，LH受體受到刺激后，外層顆粒細胞表達RNA編碼的表皮生長因子樣蛋白，從而實現LH信號從外層向內層的轉化[12]，抑制次黃嘌呤介導的分裂停滯，而誘導減數分裂重啟，促進卵母細胞的成熟。Hobbs等研究發現，在卵母細胞培養液中同時添加10 μg/mL FSH和10 μg/mL LH提高了卵母細胞的成熟率，常和 1 μg/mL E2同時添加以促進卵母細胞質的成熟[13]。馬絨毛膜促性腺激素（eCG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）一樣，具有FSH和LH的雙重作用，對FSHR和LHR具有高度親和力。研究表明eCG能提高非繁殖季節奶牛和母羊的生殖能力、排卵數和妊娠率[14-16]。Wei等在蘭州大尾綿羊卵母細胞培養液中添加20 μg/mL eCG，與添加10 IU/mL FSH相比，提高了卵母細胞成熟率（從51.7%至48.5%），減少了卵母細胞的凋亡（從19%至20.6%）[15]。 　　4 卵泡液對綿羊卵母細胞體外成熟培養的影響
　　卵泡液（follicular fluid，簡稱FF）在體內的作用機制尚未被闡明，目前，對于卵泡液能否作為卵母細胞成熟培養的添加物，觀點尚不一致。多數研究表明，卵泡液中存在類固醇激素、促性腺激素和生長因子，包括胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor-1，簡稱IGF-Ⅰ）和表皮生長因子（epidermal growth factor，簡稱EGF），能夠提高質核成熟的同步化，影響卵母細胞的成熟、受精以及胚胎的發育[17-18]。有研究報道，類固醇激素的刺激作用對于卵母細胞的成熟收效甚微，有的還起到輕微的抑制作用[19]。卵泡液中的促減數分裂甾醇（follicular fluid-meiosis-activating sterol，簡稱FF-MAS）膽固醇合成的中間產物，被認為是促進卵母細胞成熟的候選物。然而，有研究發現，FF-MAS與自發或促性腺激素誘導卵母細胞成熟的時間不同，說明膽固醇很可能不是主要促進卵母細胞成熟的因子[20]。Germoush等研究了綿羊卵泡液（sheep follicular fluid，簡稱SFF）對卵母細胞體外成熟和體外受精后早期胚胎發育的影響，結果表明，在成熟液中添加10%和20%的SFF，對成熟率和卵裂率沒有顯著影響，而在添加40% SFF的成熟液中，卵母細胞成熟率和卵裂率較添加之前顯著提高;與其他試驗組相比，在成熟液中添加10% SFF，顯著提高了囊胚的發育率[21]。然而，也有研究者認為，40%的卵泡液對卵母細胞的成熟具有抑制作用，卵泡液對體外卵母細胞成熟的影響還有待進一步研究。
　　5 生長因子對綿羊卵母細胞體外成熟培養的影響
　　卵泡卵母細胞的發育是由促性腺激素和生長因子協同調節的。體外卵母細胞成熟培養液中對卵母細胞的成熟和胚胎早期發育具有促進作用的生長因子有表皮生長因子、轉化生長因子、胰島素樣生長因子和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。
　　5.1 表皮生長因子
　　表皮生長因子是具有多功能效應的促細胞分裂因子，能刺激多種細胞的增殖，使處于G0期的細胞進入S期。研究已證明表皮生長因子能將卵泡邊緣的LH信號傳遞給COCs，是排卵信號傳導中的重要組成部分。最新研究發現，EGF信號下調體細胞信號3′，5′-環鳥嘌呤單磷酸，提供減數分裂誘導信號，引起減數分裂的恢復，同時能促進卵母細胞成熟過程中蛋白質的合成，從而提高卵母細胞的質量和受精能力[22-23]。EGF由黃體和內膜細胞產生，通過介導有絲分裂蛋白激酶3和1（MAPK3/1）途徑，從而中斷cAMP的運輸，導致分裂成熟復始，促進卵母細胞的體外成熟[24]。尹耀學等研究發現，在卵母細胞體外培養液中添加EGF可以誘導卵母細胞體外成熟[25]。
　　5.2 轉化生長因子
　　轉化生長因子是一組具有生物活性的多肽類物質，這些多肽因子能誘發原本貼壁生長的正常細胞出現可逆性轉化的表型以促使細胞生長，也能誘導指示細胞產生可逆轉化。主要分為α型TGF和β型TGF，相關結果表明，TGF-α能改善卵母細胞成熟的質量和受精后的發育潛能，然而其確切的機制還不完全清楚[10]。TGF-β是一種多功能的細胞活化素并且具有多種形式，它們屬于一個大的基因家族，在細胞生長方面具有多種作用，比如分化、遷移以及細胞外基質的形成、細胞表面分子表達的調控等[26]。最近TGF-β在卵母細胞成熟過程中的傳播途徑成為研究的熱點，TGF-β在結構和功能上調節EGF，協同作用使減數分裂恢復，而刺激卵母細胞的成熟。陳靜波等研究表明，在成熟培養液中添加1 ng/mL TGF-β 能促進豬體外卵母細胞核和裸卵的成熟[27]。
　　5.3 胰島素樣生長因子
　　胰島素樣生長因子是一種作用于多種組織和器官，具有多種生理功能的多效性營養因子多肽，能增加葡萄糖和氨基酸的吸收，抑制蛋白質降解，刺激各種細胞的增殖和分化[28]。有研究表明，IGF-Ⅰ可以誘導顆粒細胞LH受體的表達，維持卵泡的生長，抑制卵泡閉鎖，能促進卵母細胞體外成熟和體外受精[29]。趙曉娥等研究表明，在山羊卵母細胞培養液中添加IGF-Ⅰ，可以顯著提高卵母細胞成熟率，尤其是EGF和IGF-Ⅰ聯合使用時[30]。Bezerra等研究發現，在培養液中添加100 ng/mL IGF-Ⅰ能夠促進原始卵泡的激活和細胞增殖并且通過PI3K/AKT途徑減少DNA碎片的產生[31]。
　　5.4 血管內皮生長因子
　　血管內皮生長因子是一種特殊的細胞分裂劑和潛在的血管分化因子，可以促進內皮細胞增生，促進細胞遷移，抑制細胞凋亡，提高血管和微血管對大分子物質的通透性[32]。它在哺乳動物生殖調控中也起重要作用，能夠顯著提高卵丘細胞的擴散和卵母細胞的核質成熟，促進卵母細胞的體外成熟。宋凱等研究了VEGF對綿羊卵母細胞體外成熟的影響，結果表明，在含有胎牛血清（fetal bovine serum，簡稱FBS）的體系中添加VEGF能有效促進卵母細胞體外成熟和胚胎的早期發育，最適添加量為5 ng/mL[33]。Araújo等的研究表明，100 ng/mL VEGF可以代替10 ng/mL EGF+50 ng/mL IGF-Ⅰ 在體外卵母細胞成熟的過程中恢復減數分裂，調控卵母細胞的成熟[34]。但有關VEGF促進卵母細胞的成熟和早期胚胎發育的作用機制還有待進一步研究。
　　6 抗氧化物和維生素對綿羊卵母細胞體外成熟培養的影響
　　卵母細胞在體外培養的過程中，由于細胞代謝產生過量的活性氧（reactive oxygen species，簡稱ROS），會導致線粒體功能障礙，損害DNA，發生脂質過氧化反應和蛋白質的氧化變化，抑制受精率，引起細胞死亡[35]。因此，許多研究人員在卵母細胞成熟培養液和胚胎發育液中加入了多種抗氧化劑，以減少ROS對胚胎發育過程中的有害影響，如低分子量的含硫基化合物包括β-巰基乙醇、半胱氨酸、胱氨酸和半胱胺[36]。谷胱甘肽（GSH）是一種存在于卵母細胞中的天然抗氧化劑，并且在不同發育階段GSH表達量也發生變化，能夠清除對細胞發育有損害作用的過氧化物。半胱胺是能夠使胱氨酸轉化為半胱氨酸的一種低分子量硫基化合物，半胱氨酸能夠促進卵母細胞內GSH的合成[37]。郭洪等的研究表明，在綿羊卵母細胞成熟液中添加100 μmoL/L半胱氨酸能提高卵母細胞核質成熟的能力[38]。 　　7 小結與展望
　　卵母細胞成熟包括旁分泌、自分泌和自分泌體等一系列復雜的過程，所涉及的信號通路最終都轉化為對cAMP的調控。在對海星、爪蟾、哺乳動物等不同物種的研究中，在卵母細胞溫育過程中添加cAMP類似物或刺激cAMP產生的藥理學物質，導致卵母細胞內cAMP含量升高[39]，現已確認，高濃度的cAMP會抑制減數分裂的進行，使其停留在減數分裂休止期。所以卵母細胞內cAMP濃度的下降，是減數分裂恢復的前提。磷酸二酯酶（phosphodiesterase，簡稱PDE）是一種在卵巢中呈區域化分布的、專門負責第二信使cAMP和環鳥苷酸（cyclic guanosine monophosphate，簡稱cGMP）的酶[40-41]。PDE3家族和同工酶PDE4家族共同調節cAMP的平衡，Tsafriri等通過原位雜交方法，利用特異性標記的PDE3、PDE4異構體探針，結果發現PDE3主要在卵母細胞內表達，PDE4更多是在顆粒細胞中表達，但是由PDE3介導的卵母細胞內cAMP濃度的下降和由PDE4介導的顆粒細胞中cAMP濃度的上升，二者之間是否存在因果關聯還值得進一步深究[42]。
　　外胚胎技術由于能夠迅速擴繁，提高母羊的繁殖力，從而在生產上可以得到廣泛應用。綿羊卵母細胞的體外成熟是受多種因素共同作用完成的，如培養溫度、培養時間，培養液成分等，任何一種因素最終都是通過上調磷酸二酯酶的活性，平衡卵母細胞內cAMP的濃度，使減數分裂恢復，促進卵母細胞的成熟。因此，篩選出最適添加成分的組合是至關重要的。而培養出高質量的綿羊卵母細胞是體外胚胎技術的前提。在未來的研究中，借助高通量技術在基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和表觀遺傳學等領域深入研究卵母細胞生長和成熟的調控機制是提高卵母細胞培養質量的發展趨勢。
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