針刺對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脊髓鈣離子接頭蛋白-1、環氧合酶-2及血清腫瘤壞死因子-α水平的影響

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　　 摘要：目的  觀察針刺對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠脊髓鈣離子接頭蛋白-1（IBA-1）、環氧合酶-2（COX-2）及血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平的影響，探討其可能的作用機制。方法  將36只C57BL/6小鼠隨機分為4組，正常組小鼠不予處理，其余小鼠均制作EAE模型。造模后第14日開始，正常組和模型組小鼠每日抓取1次，激素組小鼠給予醋酸潑尼松灌胃，針刺組小鼠針刺雙側“腎俞”“足三里”“大椎”。造模后28 d取材，檢測小鼠血清TNF-α含量及脊髓COX-2、IBA-1陽性表達。結果  與正常組比較，模型組小鼠神經功能評分及TNF-α、COX-2、IBA-1水平均明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，針刺組和激素組小鼠神經功能評分和TNF-α、COX-2、IBA-1水平均明顯降低（P<0.01）;與針刺組比較，激素組小鼠神經功能評分和COX-2、IBA-1水平均明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結論  針刺可降低EAE小鼠炎癥反應，減輕脊髓神經損傷，其機制可能與降低血清TNF-α含量，減少脊髓COX-2、IBA-1陽性表達有關。
　　關鍵詞：多發性硬化;針刺;鈣離子接頭蛋白-1;環氧合酶-2;腫瘤壞死因子-α;實驗性自身免疫性腦脊髓炎;小鼠
　　中圖分類號：R245    文獻標識碼：A    文章編號：1005-5304（2019）05-0049-05
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.011 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：
　　Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture on the levels of IBA-1， COX-2 in spinal cord and serum TNF-α of experimental autoimmune encephalomyelitis （EAE） mice model; To clarify the mechanism of acupuncture treatment. Methods Thirty-six C57BL/6 mice were randomly divided into 4 groups. The normal group of mice were not immunologically molded， and the others were injected to replicate the EAE model. Since the 14th day after modeling， the normal group and the model group mice were taken once a day. Hormone group received prednisone acetate for gavage. Acupuncture group received acupuncture at “Shenshu”， “Zusanli”， and “Dazhui”. At the 28th day after of modeling， the content of serum TNF-α and the positive expressions of COX-2 and IBA-1 in the spinal cord were detected. Results Compared with the normal group， neurological function score， TNF-α， COX-2 and IBA-1 in the model group increased （P<0.01）. Compared with the model group， the neurological function scores and TNF-α， COX-2 and IBA-1 levels in the acupuncture group and the hormone group were significantly lower （P<0.01）. Compared with the acupuncture group， the neurological function score and COX-2 and IBA-1 levels in the hormone group were significantly lower （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Acupuncture can reduce the inflammatory response of EAE mice and alleviate spinal nerve injury. The mechanism may be related to lowering serum TNF-α content and reducing the positive expressions of COX-2 and IBA-1 in spinal cord.
　　Keywords： multiple sclerosis; acupuncture; IBA-1; COX-2; TNF-α; experimental autoimmune encephalomyelitis; mice
　　多發性硬化以中樞神經系統炎性脫髓鞘病變為主要病理變化[1]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）為國際公認的多發性硬化動物模型。EAE動物模型病變部位存在炎癥因子浸潤、神經脫髓鞘病變甚至神經細胞空泡樣壞死現象[2]。前期臨床和實驗研究表明，針刺可明顯改善多發性硬化患者臨床療效，降低EAE模型炎癥因子水平，抑制炎癥反應[3-5]?，F代研究表明，環氧合酶（COX-2）參與炎癥反應并與神經損傷關系密切，鈣離子接頭蛋白-1（IBA-1）由神經系統小膠質細胞分泌，也參與炎癥反應。核因子-κB（NF-κB）信號通路在神經損傷時被激活，生成腫瘤壞死因子-α（TNF-α）參與炎癥反應[6-8]。本實驗觀察針刺對EAE小鼠脊髓內IBA-1、COX-2和血清TNF-α水平的影響，進一步探究針刺治療EAE的作用機制。 　　1  實驗材料
　　1.1  動物
　　8～10周齡健康雌性C57BL/6小鼠36只，體質量18～20 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養于北京中醫藥大學SPF級動物房，溫度20～24 ℃，相對濕度40%～60%，明暗周期12 h，自由攝食飲水。
　　1.2  主要試劑與儀器
　　MOG35-55肽段，北京百諾威生物有限公司，批號NJP30376;完全弗氏佐劑（其中結核桿菌H37Ra終濃度為4 mg/mL），北京華菁科技有限公司，批號170597;百日咳毒素，北京百諾威生物有限公司，批號181236A1;氯化鈉注射液，華潤雙鶴藥業股份有限公司，批號201804025;醋酸潑尼松片，上海上藥信誼藥廠有限公司，批號017171002;TNF-α ELISA檢測試劑盒，聯科生物技術有限公司，貨號EK2821/2;兔抗COX-2多克隆抗體，英國Abcam公司，貨號ab15191;兔抗AIF1/Iba1多克隆抗體，英國Abcam公司，貨號ab178847。一次性0.25 mm×0.25 mm無菌針灸針，中研太和，批號172731;離心機，德國 Sartorius公司，型號Sigam1-14;光學顯微鏡，北京銳馳恒業儀器有限公司，型號CX23;石蠟切片機，沈陽裕德電子儀器公司，型號SYD-S3050;酶標儀，美國BioTeK公司，型號FLX800T。
　　2  實驗方法
　　2.1  造模
　　將MOG35-55多肽用生理鹽水稀釋至10 mg/mL，再與完全弗氏佐劑按1∶1比例充分混合至油包水乳劑，制成完全抗原。小鼠乙醚麻醉并固定，進行免疫造模。將配制好的完全抗原按0.1 mL/只在小鼠背部脊柱旁分4點皮下注射。于免疫后第0、2日腹腔內注射500 ng/只百日咳毒素，建立小鼠EAE模型[9-11]。
　　2.2  模型評價
　　從第0日開始，直到第28日實驗取材為止，每日9：00-11：00依據Kono等[12]神經功能評分標準。0分為無明顯異常;1分為動物尾部張力降低或無力，動作笨拙，輕度步態不穩定;2分為尾部無張力且后肢無力，可伴有中度步態異?；蜃藨B維持缺乏;3分為后肢力弱或癱瘓，可伴有輕度前肢無力及輕度麻痹;4分為肢體嚴重麻痹，甚至全身癱瘓，被動翻身后不能復原;5分為瀕死狀態。癥狀在二者之間按0.5分計算。將評分1～4分的小鼠納入實驗。
　　2.3  分組及干預
　　C57BL/6小鼠適應性喂養1周，采用隨機數字表法分為正常組、模型組、激素組和針刺組，每組9只，均常規飼養。正常組小鼠不做處理，其余小鼠均行EAE造模，造模當日記為第0日。小鼠造模后第14日起每日14：00-16：00進行干預。正常組和模型組小鼠每日抓取、固定1次，給予生理鹽水0.1 mL/10 g灌胃，連續15 d;激素組進行激素沖擊療法，將醋酸潑尼松片溶于生理鹽水，濃度為0.6 mg/mL，將小鼠固定后每日給予醋酸潑尼松藥液0.1 mL/10 g灌胃，連續15 d;針刺組針刺“大椎”（第7頸椎與第1胸椎之間，背部正中，直刺2～3 mm）、雙側“腎俞”（第2腰椎下兩旁，向脊柱方向斜刺2～3 mm）、雙側“足三里”（膝關節外側，腓骨小頭下0.3 cm處，直刺2～3 mm），每日針刺1次，留針15 min，共15次。第28日，小鼠眼球采血0.8～1 mL，取脊髓置于-80 ℃冰箱保存待檢。
　　2.4  指標檢測
　　每日進行小鼠神經功能評分;用ELISA試劑盒檢測小鼠血清TNF-α含量;用兔抗COX-2多克隆抗體、兔抗AIF1/Iba1多克隆抗體和免疫組化檢測小鼠脊髓COX-2、IBA-1陽性表達平均光密度（MOD）。
　　3  統計學方法
　　采用SPSS20.0統計軟件進行分析。實驗數據以±s表示，進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。
　　4  結果
　　4.1  針刺對模型小鼠神經功能評分的影響
　　第0日，小鼠神經功能評分均為0分;第12日模型組小鼠開始出現輕度動作笨拙、步態不穩癥狀，神經功能評分為（0.11±0.22）分，其余組別未有變化;模型組第20日時評分達到峰值（3.11±0.42）分，之后評分逐漸減少;針刺組小鼠第16日出現尾部張力降低或無力，動作笨拙等神經功能異常癥狀，神經功能評分為（0.89±0.33）分，第24日神經功能評分最高（2.06±0.30）分，之后評分有所下降;激素組小鼠第16日出現尾部張力降低或無力，輕度步態不穩，神經功能評分為（0.44±0.30）分，第24日評分達到峰值（1.67±0.35）分。結果見表1。
　　4.2  針刺對模型小鼠脊髓環氧合酶-2、鈣離子接頭蛋白-1表達的影響
　　與正常組比較，模型組小鼠脊髓COX-2、IBA-1陽性表達明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，針刺組和激素組小鼠脊髓COX-2、IBA-1陽性表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）;與針刺組比較，激素組小鼠脊髓COX-2、IBA-1陽性表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。結果見表2。
　　4.3  針刺對模型小鼠血清腫瘤壞死因子-α含量的影響
　　與正常組比較，模型組小鼠血清TNF-α含量明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，針刺組和激素組小鼠血清TNF-α含量明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）;與針刺組比較，激素組小鼠血清TNF-α含量無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表3。 　　4.4  免疫組化染色結果
　　COX-2、IBA-1主要存在于EAE模型小鼠脊髓胞漿內，表現為黃色或棕黃色顆粒。正常組小鼠脊髓細胞形態規則，染色均勻，細胞染色多為藍色，胞漿內可見少量COX-2、IBA-1黃色顆粒。與正常組比較，模型組小鼠脊髓胞漿內黃色顆粒明顯增多，細胞體積增大，形態呈不規則狀，COX-2、IBA-1含量明顯增加;與模型組比較，針刺組和激素組小鼠脊髓胞漿內黃色顆粒有所減少，細胞形態較規則，COX-2、IBA-1含量降低;與針刺組比較，激素組小鼠脊髓胞漿內黃色顆粒較少，染色較淺，正常細胞數量較多，細胞形態較規整。結果見圖1、圖2。
　　5  討論
　　多發性硬化發作時，參與的主要免疫細胞有T細胞和巨噬細胞。中樞神經脫髓鞘病變，刺激小膠質細胞發生免疫反應，生成大量炎癥因子，隨著病情進展，外周T細胞、巨噬細胞、炎癥因子等通過血腦屏障，在中樞神經系統發生免疫反應，產生大量促炎因子，炎癥級聯反應導致過度炎癥反應，損傷神經髓鞘，影響神經功能[13-14]。此外，小膠質細胞還可呈遞抗原給T細胞、巨噬細胞，加重炎癥反應、神經損傷[15]。EAE動物造模機制與多發性硬化相似，與炎癥反應關系密切，動物血腦屏障被破壞，產生炎癥因子進入中樞神經，誘導發生過度炎癥反應，造成神經炎性、脫髓鞘病變[16]。
　　COX-2是花生四烯酸轉化為前列腺素的限速酶，通常COX-2分泌很少或不分泌，炎癥反應時明顯增多。EAE小鼠COX-2 mRNA表達水平明顯升高，COX-2通過PI3K-Akt、JNK1/2等炎癥相關信號通路促進炎癥反應，并誘導產生其他炎癥因子，通過血腦屏障，激活小膠質細胞，促進炎癥反應，攻擊神經髓鞘，加重中樞神經損傷[17-20]。敲低lincRNA-Cox2可促進小膠質細胞自噬、抑制巨噬細胞激活，使小膠質細胞處于靜息狀態，減輕炎癥損傷，減少EAE發病，改善EAE臨床癥狀[21]。小膠質細胞受炎癥刺激活化變形時會產生IBA-1、TNF-α，二者均可促進炎癥因子釋放，形成炎癥級聯反應，加重炎癥反應[22-23]。此外，巨噬細胞在神經系統受到炎癥刺激時活化，也會產生IBA-1，促進炎癥反應[24]。
　　多發性硬化屬中醫學“風痱”“痿證”“痹證”范疇，多有外感史，邪毒外襲，素體虧虛，無力抗邪而發病，或內生邪毒阻滯脈絡，痰瘀內生，蘊集于髓腦，清陽不升，濁陰不降，筋脈失養，久而成疾[25]。病位在腦、脊髓，與腎、脾、胃相關，證屬腎精虧虛，后天不足，髓腦失養。腎為后天之本，腎生髓，腎精虧虛，化髓無源，髓?？仗?，腦失髓養而發。腎精不足，損及腎陽，腎陽虧虛，鼓動無力，精髓無力上呈，髓腦失養加重。本研究選穴為腎俞（雙側）、大椎。腎俞屬足太陽膀胱經，為腎臟背腧穴?！鞍螂鬃闾栔}，起于目內毗，上額，交巔……其直者，從巔入絡腦”（《靈樞·經脈》）。針刺雙側腎俞可補腎益髓，助陽化髓，補益髓腦，亦可疏通膀胱經脈，促進髓、腦精微物質循環。足三里屬足陽明胃經，是胃經的合穴。臨床素有“治痿獨取陽明”，陽明經多氣多血，針刺足三里可補益氣血，濡養經筋。脾胃位于中焦，針刺足三里可補益中焦、固護后天、濡養先天。大椎屬督脈，是督脈與手足三陽經的交會穴，為“諸陽之會”。督脈為“陽經之?！?，主一身之陽氣，行于背部正中，上至風府，入屬于腦，腦、脊髓精液通過督脈相溝通，針刺大椎，可振一身之陽氣，助腎髓上行于腦[26]。此外，針刺大椎，升發陽氣，還可抵抗邪毒，驅邪外出。針刺腎俞（雙側）、大椎可補腎益髓、升陽化髓，驅邪外出，治療多發性硬化具有良好的效果。
　　本實驗結果表明，模型組較正常組小鼠神經功能評分、血清TNF-α含量及脊髓COX-2、IBA-1表達均明顯升高;針刺與激素治療后明顯降低EAE小鼠神經功能評分，延遲EAE發作，且EAE小鼠血清TNF-α含量、脊髓COX-2、IBA-1表達均明顯降低;激素組較針刺組在改善小鼠神經功能評分及脊髓組織COX-2、IBA-1陽性表達方面效果更明顯。
　　綜上，對EAE小鼠采用激素沖擊或針刺治療，均可降低EAE模型小鼠COX-2、IBA-1、TNF-α水平，降低EAE神經功能評分，說明激素沖擊、針刺治療均可延遲、減輕EAE小鼠神經損傷。雖然與針刺治療相比，激素沖擊療法降低EAE小鼠神經功能評分及降低脊髓COX-2、IBA-1表達效果更佳，但激素沖擊治療不良反應大。所以，針刺EAE小鼠“腎俞”“足三里”“大椎”可安全有效地抑制中樞神經炎癥反應，延遲、減輕神經功能損傷，抑制小膠質細胞活化，降低炎癥反應，保護脊髓神經，治療多發性硬化。今后將進一步深入研究，明確針刺治療EAE小鼠作用靶點、信號傳導通路及其對基因表達的影響。
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　　（收稿日期：2018-09-19）
　?。ㄐ藁厝掌冢?018-10-08;編輯：華強）
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