雜交構樹莖段組織培養體系的建立

來源:用戶上傳      作者:

　　摘要：以雜交構樹[Broussonetia papyrifera （L.） Vent.]——中科一號為試驗材料，通過對雜交構樹莖段的離體培養和擴繁，探究了不同激素配比對雜交構樹誘導愈傷、叢生芽、壯苗和生根的影響。試驗結果表明，以具腋芽的構樹莖段為外植體材料，75%乙醇溶液浸泡 40 s后，再經0.3% HgCl2滅菌15 min，外植體的成活率可達44%;誘導愈傷組織的最佳培養基為MS+IBA 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂7.0 g/L，pH 5.6～5.8，愈傷誘導率達90%;誘導叢生芽的最佳培養基為MS+IBA 1.5 mg/L+6-BA  2.0 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂7.0 g/L，pH 5.6～5.8，叢生芽增殖系數為4.2，生長勢較好;壯苗的最佳培養基為MS+IBA 0.2 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂7.0 g/L，pH 5.6～5.8，平均株高4.8 cm;生根的最佳培養基為1/2 MS+IBA 0.8 mg/L+活性炭1.5 g/L+馬鈴薯50 g/L+蔗糖25 g/L+瓊脂7.0 g/L，pH 5.6～5.8，生根率100%。最佳的煉苗移栽基質土為珍珠巖∶蛭石∶草炭=1∶1∶1的混合基質，幼苗生長得最好，平均株高為7.3 cm。
　　關鍵詞：雜交構樹[Broussonetia papyrifera （L.） Vent.];組織培養;愈傷組織;叢生芽
　　中圖分類號：Q813.1;S792         文獻標識碼：A
　　文章編號：0439-8114（2019）09-0120-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.029           開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：
　　Abstract： The hybrid tree[Broussonetia papyrifera （L.） Vent.]—Zhongke No. 1 was used as the experimental material， through the culture and expansion of the stem segments of the hybrid tree in vitro， the effects of different hormones on callus， shoot buds， strong seedlings and roots were studied. The results showed that the survival rate of explant material， stems of the buds with axillary buds， could reach 44%， after immersed in 75% ethanol solution for 40 s， then sterilized by 0.3% HgCl2 for 15 min. The optimal medium for inducing callus is MS+IBA 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+sucrose 25 g/L+agar 7.0 g/L， pH 5.6～5.8， the callus induction rate reached 90%. The optimal medium for inducing cluster buds was MS+IBA 1.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+sucrose 25 g/L+agar 7.0 g/L，pH 5.6～5.8， the growth coefficient of cluster buds is 4.2， and the growth potential is good. The optimal medium for strong seedlings is MS+0.2 mg/L IBA+6-BA 1.5 mg/L+sucrose 25 g/L+agar 7.0 g/L， pH 5.6～5.8， average plant height is 4.8 cm. The optimal medium for rooting is 1/2 MS+IBA 0.8 mg/L+activated carbon 1.5 g/L+potato 50 g/L+sucrose 25 g/L+agar 7.0 g/L，pH 5.6～5.8， rooting rate is 100%. The best seedling transplanting substrate soil is a mixed substrate of peat∶perlite∶vermiculite=1∶1∶1. The seedlings grow best， with an average plant height of 7.3 cm.
　　Key words： hybrid Broussonetia papyrifera; tissue culture; callus; bush bud
　　構樹（Broussonetia papyrifera），別名楮樹、谷漿樹、野楊梅子等，為?？疲∕oreceae）構樹屬（Broussonetia）多年生雌雄異株落葉喬木，樹冠張開，全株含乳汁，普通構樹小枝和側芽均密生柔毛[1]。其根與果實均可入藥，且具有強筋骨、補腎、利尿之功效，能治腰膝不適等癥狀，果實中的紅色素還具有一定的抗氧化作用[2];其側芽和葉片幼嫩時可食，戚亞偉等[3]研究表明，構樹葉對小鼠因攝食過多而導致的肥胖有治療效果，并能促進其體內油脂代謝，減少內臟脂肪。構樹的材質潔白，纖維素含量高且表面光滑，和其樹皮一直是造紙業及新型紡紗業等的優質原料[4，5];其乳汁不僅能醫治瘡癬等皮膚病，還具有開發成生物殺蟲劑的潛力，能殺死一些蔬菜害蟲[6]。其還具有吸附空氣中有害氣體和灰塵、凈化空氣的功能，是較為優良的生態園林綠化樹種[1]。瞿曉晶等[7]研究表明，構樹種子油對羥基等自由基的抑制率高達93.56%。因此，構樹全身都是寶，其開發和利用一直受到國內外學者的廣泛關注，經濟潛力很大[8]。 　　由中國科學院選育的雜交構樹[Broussonetia papyrifera （L.） Vent.]——中科一號，不僅具有普通構樹的優良特性，而且具有速生、適種地廣、抗逆性強、易繁殖、熱量高、輪伐期短等栽培特性[9]，更適用于造紙業的需求[10]。在中國，不論平原、丘陵或山地，雜交構樹都能旺盛生長，是良好的經濟林和生態林品種[11]。其根系淺，側根分布很廣，生長快、萌芽力和分蘗力強，可避免水土流失;其葉片無柔毛且富含大量的粗蛋白質以及類黃酮，具有抑菌抗癌的作用[12-15]，無需施用農藥和激素，且具清香味，因此更適用于保健蔬菜、茶葉的制作以及各種飼料添加物的加工和制備[12，14]。
　　構樹種子人工播種的發芽率低，僅4%，且后代會發生性狀分離，無法保證母本的優良性狀，因此構樹苗木主要靠扦插繁殖[1]，但扦插難以滿足當前大面積栽培及推廣的需要，扦插苗后期主干容易空心且長勢較弱，而利用組培快繁的技術正好可以解決雜交構樹資源短缺與需求量日益增長之間的矛盾[16]。為此，試驗通過優化消毒方法和激素配比，進行愈傷組織、叢生芽和生根的誘導，建立了雜交構樹的組織培養體系，旨在為構樹的大量快繁奠定基礎，同時，也可減輕對構樹野生資源的采挖和破壞，實現良好的生態效益。
　　1  材料與方法
　　1.1  試驗材料
　　試驗材料從湖北省農業科學院果樹茶葉研究所構樹試驗園采集。選擇晴天上午采集生長健壯、無病害的幼嫩構樹枝條，以帶腋芽的構樹枝條為宜，采集200條，將樣品帶回實驗室，進行外植體的消毒和接種。
　　1.2  試驗方法
　　1.2.1  試驗條件  以MS為基本培養基，主要調整激素種類和濃度形成不同培養基組合，16 h光照/8 h黑暗，光照度3 000 lx，培養溫度（24±1） ℃。
　　1.2.2  試驗材料的獲取及消毒  選取健壯的構樹枝條為外植體，首先將枝條放入加有洗潔精或吐溫40的水中浸泡20 min，然后將構樹枝條在自來水下沖洗30 min，除去其表面泥土和灰塵，按1～2 cm的長度且都帶腋芽為標準剪成莖段，再將沖洗干凈的外植體放入超凈臺中，用75%乙醇浸泡40 s，經無菌水沖洗3次，再置于消毒劑中滅菌，并設置空白對照（無菌水）。消毒劑分別為2% NaClO、0.3% HgCl2和10% H2O2溶液，滅菌時間分別設定為5、10、15 min。并用無菌水沖洗4次，用無菌濾紙吸干構樹側芽表面水分，切除兩端因消毒壞死的組織，迅速將側芽接種到培養基中，每瓶接種2個，25瓶為一個小組，共接種12組，光照培養室中培養10 d后統計側芽的污染率、滅菌死亡率和成活率。
　　1.2.3  愈傷組織及叢生芽的誘導  以MS+瓊脂7 g/L+蔗糖25 g/L（pH 5.6～5.8）為基礎培養基，加入不同濃度的IBA和6-BA。IBA設置0.1、0.5、1.0、1.5 mg/L等4個水平，6-BA設置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 等5個水平。將1 cm左右的構樹莖段（帶腋芽）接入培養基中進行培養。一共20個處理，每個處理20瓶，每瓶接種3株無菌芽苗，培養30 d后觀察并記錄愈傷組織及芽苗的生長情況。
　　1.2.4  壯苗培養基的篩選  以MS+瓊脂7 g/L+蔗糖25 g/L+馬鈴薯（榨汁）50 g/L（pH 5.6～5.8）為基礎培養基，加入不同濃度的6-BA和IBA。6-BA設置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L等5個水平，IBA設置0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L等4個水平。選擇長勢較好的基礎苗進行壯苗，一共20個處理，每個處理20瓶，每瓶接種3株無菌芽苗。接種后置于光照培養室中，30 d后觀察并記錄壯苗結果。
　　1.2.5  構樹生根培養基的篩選  以1/2 MS+瓊脂 7 g/L+蔗糖25 g/L+活性炭1 g/L+馬鈴薯（榨汁）  50 g/L（pH 5.6～5.8）為基礎培養基，加入不同濃度的IBA。IBA設置0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L等5個處理，每個處理20瓶，每瓶接種3株無菌芽苗，培養30 d后觀察并記錄構樹植株的生根和生長情況。
　　1.2.6  構樹的煉苗和移栽  將長有構樹幼苗的培養瓶轉移至煉苗溫室內，開蓋煉苗2 d后，洗干凈幼苗根部黏附的培養基，將幼苗移入珍珠巖∶蛭石∶草炭=1∶1∶1混合基質的營養缽中并澆足水，用噴霧保濕，同時注意通風，隨后逐漸降低濕度，30 d后移出煉苗溫室，讓幼苗在自然條件下生長，觀察并記錄移栽結果。
　　2  結果與分析
　　2.1  不同消毒方法的比較
　　從表1可以看出，消毒效果最好的處理是75%乙醇溶液浸泡40 s后再用0.3% HgCl2滅菌15 min，除菌率可以達到68%，外植體的成活率可達44%。
　　2.2  雜交構樹愈傷組織及叢生芽誘導培養基的篩選
　　雜交構樹莖段在誘導培養基中培養30 d后，觀察不同激素配比下芽苗的增殖系數與芽苗生長狀況。由表2可知，在IBA濃度一定的情況下，隨著6-BA濃度的升高產生愈傷增加;在6-BA濃度一定的情況下，隨著IBA濃度的升高，產生愈傷組織也有類似的增加趨勢。產生愈傷的最佳培養基為MS+IBA 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂7.0 g/L（pH 5.6～5.8），誘導愈傷組織的效果最明顯，誘導率為90%，生長勢也較好;而產生叢生芽的最佳培養基為MS+IBA 1.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂7.0 g/L（pH 5.6～5.8），愈傷組織的誘導率雖然僅為55%，但是叢生芽增殖系數為4.2，生長勢也較好。 　　2.3  雜交構樹壯苗培養基的篩選
　　由表3分析可得，對壯苗影響較大的激素為6-BA，當6-BA濃度為1.5 mg/L，IBA濃度為 0.5 mg/L時，壯苗效果最明顯，雖然叢生芽增殖系數僅為3.8，但是此時芽苗的平均株高為4.8 cm。由此可得壯苗效果最佳的培養基配方為MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.20 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂7.0 g/L（pH 5.6～5.8）。
　　2.4  雜交構樹生根培養基的對比結果
　　以1/2 MS為基本培養基加IBA和馬鈴薯汁可加快雜交構樹組培苗生根，接種至生根培養基10 d后可以看到根原基分化出的愈傷組織，15 d后就可看到誘導出許多細小的不定根，30 d后生根的結果就趨于穩定了。從表4可以看出，隨著IBA濃度的升高生根率增加，當IBA濃度為0.8和1.0 mg/L時，生根率均為100%?？紤]到激素過高可能會影響細胞活性等因素，選取低濃度的IBA，故最佳的生根培養基為1/2 MS+IBA 0.8 mg/L+活性炭1.5 g/L+馬鈴薯50 g/L+蔗糖25 g/L+瓊脂7.0 g/L（pH 5.6～5.8）。
　　2.5 構樹幼苗的馴化移栽
　　從表5可以看出，雜交構樹幼苗在移栽到蛭石和草炭中的成活率要明顯高于珍珠巖，可能是由于珍珠巖不保水，移栽后的幼苗容易失水，嚴重萎蔫，生長不良;但是在珍珠巖∶蛭石∶草炭（1∶1∶1）混合的基質土中的幼苗生長最好，移栽25 d后，平均株高為7.3 cm，長高了2～3 cm，不僅原來的根系更長更壯，新根也出了1～2條，側芽也明顯變大。
　　3  小結與討論
　　試驗對雜交構樹品種中科一號的莖段進行組織培養，通過調整激素配比，構建了一套能運用于試驗和小規模生產的組織培養體系，為后續高效的組織培養試驗奠定了基礎。發展雜交構樹符合“以樹代糧”和“綠水青山就是金山銀山”的發展理念，對于改善農業發展，構建良好生態環境都具有促進作用，是一項能為社會帶來生態效益和經濟效益的工作，而無菌的脫毒材料是構樹組織培養和大量擴繁的重要前提。雜交構樹莖段的消毒，時間過長可能會對構樹莖段尤其是對腋芽造成毒害，影響其活力;時間過短則會造成消毒不徹底。本試驗的最佳滅菌方法為75%乙醇溶液浸泡40 s后，再用0.3% HgCl2滅菌15 min，除了考慮選擇何種滅菌劑外，還綜合考慮了滅菌時間對滅菌效果的影響[17，18]。
　　在組織培養中，生長素類物質的主要作用是促進根和莖等組織的延伸和生長，誘導外植體產生愈傷組織;細胞分裂素類物質的主要作用是促進細胞的分裂和分化，誘導體胚和不定芽的形成。在離體條件下，器官的誘導并不是由某種生長激素的濃度所決定，而是由那些參與分化的物質間的比例關系所決定，當 6-BA與IBA的比例低時有利于愈傷組織的形成和芽的生長;比例高時有利于芽的分化[18]。本試驗研究結果表明，誘導愈傷組織分化時6-BA與IBA的適宜比例為4∶1;壯苗時6-BA與IBA的適宜比例為4∶3;用IBA生根效果就很好，與劉蕓等[18]、曹幫華等[19]、萬文等[20]報道的生長激素使用趨勢相符合。
　　參考文獻：
　　[1] 周  璟，陳中義，李華成.野生植物構樹的生物學、生態學及園林應用[J].長江大學學報（自然科學版），2015，12（15）：9-12，26.
　　[2] 龐素秋.中藥楮實子的抗衰老活性成分及其品質評價[D].上海：第二軍醫大學，2006.
　　[3] 戚亞偉，李  勇，趙云濤，等.構樹葉對營養性肥胖小鼠脂肪代謝與抗氧化機能的影響[J].動物醫學進展，2014，35（4）：49-53.
　　[4] 郭光振，張同華.構樹纖維微觀結構特點及應用前景[J].中國纖檢，2011（21）：76-79.
　　[5] 張秋玉，李遠發，梁  芳.構樹資源研究利用現狀及其展望[J].廣西農業科學，2009（2）：217-220.
　　[6] 王克榮，蘆大蘭，楊森安.構樹葉汁液可以防治蔬菜害蟲[J].長江蔬菜，2005（12）：47.
　　[7] 瞿曉晶，彭芳芳，尹楹富，等.構樹種子油的超聲強化提取及其抗氧化性研究[J].天然產物研究與開發，2014（10）：1685-1689.
　　[8] 楊小建，王金錫，胡庭興.中國構樹資源的綜合利用[J].四川林業科技，2007（1）：39-43.
　　[9] 李  毅.雜交構樹體細胞胚誘導及人工種子的制備[D].大連：大連工業大學，2015.
　　[10] 白淑云，劉秉鉞，何連芳.造紙原料新材種——雜交構樹[J].湖南造紙，2008（04）：7-9.
　　[11] 張朝暉.構樹體細胞胚懸浮培養關鍵技術研究[D].大連：大連工業大學，2016.
　　[12] 屠  焰，刁其玉，張  蓉，等.雜交構樹葉的飼用營養價值分析[J].草業科學，2009，26（6）：136-139.
　　[13] 劉建楠.構樹葉總黃酮對肝癌HepG-2細胞增殖和凋亡作用的研究[D].桂林：桂林醫學院，2012.
　　[14] 李萬倉.構樹葉活性成分分析及抑菌作用研究[D].武漢：華中科技大學，2008.
　　[15] 開偉華，寇婉青，程  正，等.構樹皮總黃酮提取及抗菌活性研究[J].安徽中醫藥大學學報，2015（3）：93-96.
　　[16] 張  偉.雜交構樹組培快繁技術概況[J].農業科技通訊，2016（6）：295-296.
　　[17] 劉中兵.光葉楮組織培養再生體系建立研究[D].武漢：華中農業大學，2009.
　　[18] 劉  蕓，郭龍妹，任淼輝，等.雜交構樹組培快繁體系的建立[J].山西農業科學，2016，44（8）：1073-1076.
　　[19] 曹幫華，宋麗紅，劉欣玲.光葉楮組織培養和快速繁殖技術的研究[J].山東科學，2006，19（2）：29-32.
　　[20] 萬  文，劉忠華，魏會琴.雜交構樹莖段組培快繁體系的建立[J].福建林業科技，2010，37（1）：72-76.
　　收稿日期：2018-11-19
　　基金項目：湖北省農業科技重點課題與平臺專項（2017-620-005-003）;湖北省農業科技創新中心項目（2017-620-005-001）
　　作者簡介：田  瑞（1978-），男，湖北荊門人，副研究員，碩士，主要從事果樹種質資源的研究工作，（電話）15971470058（電子信箱） 79011129@qq.com;通信作者，秦仲麒（1962-），男，研究員，（電子信箱）zhongqiqin@163.com。
轉載注明來源:http://www.hailuomaifang.com/8/view-14893285.htm