外泌體在促進非小細胞肺癌腦轉移中的作用

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　　[摘要]目的 探討外泌體（Exosomes）促進非小細胞肺癌腦轉移的作用，為今后的臨床診療工作提供有價值的參考依據。方法 采用電鏡觀察和Western blot檢測鑒定收集的培養非小細胞肺癌上清中含有的源性Exosomes；利用Exosomes熒光染色與受體NHA細胞共培養，明確Exosomes對受體NHA細胞的作用形式及對NHA細胞活性的影響，并建立體外血腦屏障模型驗證外泌體是否參與了非小細胞肺癌穿過血腦屏障轉移入腦的過程。結果 分離獲得的crExo樣品在電鏡下呈現為圓形，直徑30～1000 nm。Western blot結果顯示，crExo樣品表達Exosomes標志物蛋白CD63、CD9，對albumin為輕微表達，對內質網蛋白標志物calnexin則不表達。非小細胞肺癌細胞株crExoh濃度檢測結果顯示，晚期crExo蛋白濃度顯著高于早期，差異有統計學意義（P<0.05）。染色觀察細胞遷移率，結果顯示，Exosomes參與了非小細胞肺癌穿過血腦屏障的過程。結論 Exosomes對腫瘤的增殖、侵襲和轉移等生物學行為具有重要的調控作用，非小細胞肺癌發生腦轉移也受Exosomes的影響。
　　[關鍵詞]非小細胞肺癌；腦轉移；作用；研究
　　[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2019）5（b）-0056-04
　　Role of Exosomes in promoting brain metastasis of non-small cell lung cancer
　　TANG Xiao-mei YI Xiang-jun ZHANG Li
　　Department of Oncology， Jiangxi Chest Hospital， Nanchang 330006， China
　　[Abstract] Objective To explore the role of Exosomes in promoting brain metastasis of non-small cell lung cancer， so as to provide the valuable reference for future clinical diagnosis and treatment work. Methods The exogenous Exosomes contained in the cultured non-small cell lung cancer supernatant were observed by electron microscopy and identified by Western blot. Exosomes fluorescent staining and co-culture of receptor NHA cells wee used to determine the role form of Exosomes on the receptor NHA cells and the effect on NHA cell activity， and establish an in vitro blood-brain barrier model to verify whether Exosomes are involved in non-small cell lung cancer in the process of transferring the blood-brain barrier into the brain. Results The crExo sample obtained by the separation was circular under the electron microscope and had a diameter of 30 to 1000 nm. Western blot results showed that the excretion marker proteins CD63 and CD9 were expressed in the crExo sample， which was slightly expressed in albumin and not expressed in the endoplasmic reticulum protein marker calnexin. The detection of crExoh concentration in non-small cell lung cancer cell lines showed that the late crExo protein concentration was significantly higher than that in the early stage， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Cell migration was observed by staining， and the results showed that Exosomes was involved in the process of non-small cell lung cancer crossing the blood-brain barrier. Conclusion Exosomes plays an important role in the regulation of tumor growth， invasion and metastasis. The brain metastasis of non-small cell lung cancer is also affected by Exosomes. 　　[Key words] Non-small cell lung cancer； Brain metastasis； Role； Research
　　雖然臨床對多發腦轉移瘤疾病近年來可以通過手術、全腦或立體定向放射、輔助化療等多種方式實施綜合性治療，但因血腦屏障的存在，使得很多化療藥物無法進入腦內發揮作用，以致非小細胞肺癌腦轉移的預后仍然很差[1-3]。本研究旨在探討外泌體（Exosomes）促進非小細胞肺癌腦轉移的作用。為了證實該設想擬通過鑒定收集的培養非小細胞肺癌的上清中含有源性Exosomes；通過Exosomes與體NHA細胞共培養，明確Exosomes對NHA細胞活性的影響，建立體外血腦屏障模型驗證Exosomes是否參與了非小細胞肺癌穿過血腦屏障轉移入腦的過程，以期為非小細胞肺癌腦轉移的防治提供新的研究方向。
　　1材料與方法
　　1.1細胞培養
　　人非小細胞肺癌細胞株A549，使用含有10%滅活胎牛血清和雙抗的RPMI1640培養液，于37℃、5%CO2、85%濕度的恒溫箱內培養，0.25%胰酶消化液消化傳代。所有實驗均采用對數生長期細胞。細胞完全培養液的成分為含有胎牛血清、青鏈霉素雙抗溶液的或培養基。
　　1.2 Exosomes的制備
　　A549細胞經過48 h的培養之后，將細胞上清液留取下來，并將其用于Exosomes的制備過程中。上清液需要通過離心等方式將細胞碎片及雜質除去：在1500 r/min的條件下處理10 min左右，在4℃的環境中、10 000 r/min的條件下處理30 min左右，最后以100 000 r/min的條件下，4℃的環境中，進行離心處理2 h左右，棄上清，將沉淀通過200 μl的PBS實施重懸處理，懸液Exosomes，于-80℃保存。
　　1.3 Exosomes的形態觀察
　　采用透射電子顯微鏡對血清外泌體的具體形態進行觀察：在封口膜上放置100目的載樣銅網，將20 μl外泌體溶液采用等體積的PBS進行充分稀釋，隨后滴加到銅網，在室溫條件下靜止放置1 min左右，并在此環境中將其晾干。接著采用20 μl濃度為3%的磷鎢酸鈉溶液置于銅網上，進行負染處理1 min左右，隨后采用濾紙將多余的液體吸去。將銅網放到透射電鏡中之后進行抽真空處理，對外泌體形態進行觀察并拍攝相關照片。根據鏡下外泌體的實際濃度水平和具體表現出來的背景顏色，對稀釋的倍數和染色處理的時間進行適當的調整。以隨機的方式對50個Exosomes的直徑水平進行測量。
　　1.4 BCA蛋白定量
　　根據BCA試劑盒說明書所敘述的方法進行操作，將經過稀釋處理后的0.5 mg/ml crExo蛋白標準品按照0、1、2、4、8、12、16、20 μl加至96孔板中，每孔體積用PBS補充至20 μl；在3種樣本中各加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液，在4℃的環境下進行震蕩處理30 min左右；在15 000 r/min的條件下，4℃的環境中，進行30 min左右的離心處理，取上清液作為蛋白樣品。取適量同樣經過稀釋處理的3種Exosomes樣品懸液20 μl加入到96孔板當中，每個樣品設置復孔數為3個；各孔加入BCA工作液200 μl，37℃放置30 min，放入酶標儀562 nm處測定蛋白濃度。
　　1.5 Western blot檢測CD63
　　Exosomes懸液總蛋白的提取使用蛋白抽提液，蛋白濃度水平的測定采用全自動生化分析儀。取同量蛋白上樣于濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳處理，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上并置于濃度為5%的脫脂奶粉TBST中，在4℃的環境下進行封閉過夜放置，加封閉液稀釋的一抗（1∶200）過夜，用TBST進行洗膜3×15 min，加封閉液稀釋處理HRP標記為二抗（1∶2000），在4℃的環境下過夜放置，TBST洗膜時間3×30 min，通過爆光使其顯色。
　　1.6體外血腦屏障模型實驗
　　HBMEC細胞的培養。差速離心法離心，A549細胞培養上清，收集、獲得Exosomes。把Transwell置于一個24孔板中，在小室上層種入1×105個HBMEC細胞，在下層位置加入500 μl含有濃度為10%的胎牛血清DMEM培養基，在37℃的環境中放入CO2培養箱進行過夜培養處理，在確定能夠觀察到HUVEC已經長成較為完整的單細胞層之后可以進行下一步操作。取人非小細胞肺癌細胞，制成濃度為2×105個細胞/ml的單細胞懸液。將已經完全鋪滿HBMEC細胞Transwell小室，將其置入到新的24孔板當中，在小室的上層位置加入劑量為200 μl的細胞懸液，在下層位置加入劑量為500 μl的無清培養基及加有10×103、100×103經過離心處理之后獲得的Exosomes，注意下層位置的培養液和小室間需要氣泡的產生，每個樣本均需要做3個復孔。37℃恒溫，CO2培養箱內培養12 h。終止培養，將培養的小室取出，采用棉簽擦去Transwell膜靠近內室面細胞。將Transwell小室置入到加有濃度為4%多聚甲醛24孔細胞培養板當中，在室溫條件下對Transwell膜上細胞進行固定處理3 h左右。將小室取出之后采用PBS進行2次漂洗，置于加有濃度為0.1%的結晶紫溶液的24孔細胞培養板當中，經過染色處理1 h之后進行再次漂洗，在顯微鏡下對細胞進行觀察并計數。
　　1.7統計學方法
　　采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。
　　2結果
　　2.1 Western blot檢測結果
　　crExo樣品電鏡下呈圓形，直徑30～1000 nm。crExo樣品表達Exosomes標志物蛋白CD63、CD9，對albumin表達較為輕微，對內質網蛋白標志物calnexin則不表達。Exosomes樣品中TMEM88蛋白的表達情況詳見圖1。 　　2.2 BCA檢測結果
　　采用BCA法檢測非小細胞肺癌細胞株的血清crExo濃度，結果提示，晚期crExo蛋白濃度為（21.51±7.03）mg/ml，顯著高于早期的（13.46±5.67）mg/ml，差異有統計學意義（t=21.4534，P<0.05）。
　　2.3體外血腦屏障模型實驗結果
　　染色觀察細胞遷移率，結果顯示，Exosomes參與了非小細胞肺癌穿過血腦屏障過程。
　　3討論
　　非小細胞肺癌患者發生腦轉移，預示著病情已經入晚期，腦轉移不僅僅使患者的神經、認知、情感、生活能力等多個方面出現障礙，同時會對生存造成嚴重影響[4]。對于多發腦轉移瘤近年來臨床上主要主張通過手術、全腦或立體定向放射、輔助化療等方式進行綜合治療[5]。但由于血腦屏障的存在，使得很多化療藥物無法進入腦內發揮作用，導致非小細胞肺癌腦轉移的預后仍然很差，中位總生存期不超過1年。腫瘤的侵襲轉移是指上皮-間質轉化，上皮表型逐漸丟失如E-cadherin，而獲得間質表型如Vimentin等，腫瘤細胞與原發生長部位完全脫離之后，可以通過各種可能的途徑進行進一步的轉運，在與原發部位距離相對較遠的器官或組織，繼續進行病理性的增殖生長，形成性質完全相同的腫瘤病灶的一個過程，屬于惡性腫瘤病變最為重要的一個生物學特征性表現。通過上述的治療措施進行干預，并不能夠真正意義上對非小細胞肺癌腦轉移病情的發生和進展產生良性影響[6-7]。
　　目前臨床及相關領域對導致非小細胞肺癌病灶腦轉移發生的主要機制還不是十分的明確，忽略了腫瘤生存微環境與腫瘤病灶之間所產生的相互作用是其中最主要的一個原因[8-9]。腫瘤細胞在特定的環境下，會表現出特定的表型，主要表現為腫瘤組織結構和生長方式的特異性，造成腫瘤細胞的不斷異常生長，并以特殊生長方式存在的正是腫瘤微環境給腫瘤細胞的生長所提供的便利條件[10]。如果要使腫瘤細胞的這種特有的生長方式發生改變，應該首先對能夠促進其發展壯大的微環境進行干擾，只有使其所處環境發生根本性的改變，腫瘤細胞的增長態勢才能夠從根本上得到有效控制，因此，腫瘤病變的發生不僅與某種基因突變有關，腫瘤與腫瘤細胞間、腫瘤與正常細胞間以及腫瘤與其所處的微環境之間存在相互作用是最重要的原因[11-12]。因此，研究腫瘤細胞與腫瘤微環境之間的相互作用更為重要。腫瘤細胞和非腫瘤細胞所分泌出來的多種細胞因子、生長因子、黏附分子、細胞外基質蛋白會對腫瘤微環境中的細胞間通訊起到一定的介導作用，并為癌細胞的存活和生長提供條件[13]。相關研究顯示，Exosomes屬于腫瘤生長微環境的重要組成部分之一，是這些分子進入到腫瘤微環境當中的一種較為主要的方式，可以對腫瘤所導致出現的免疫抑制、血管生成、轉移前微環境的形成起到有效的抑制作用。在腫瘤病變的發展和轉移過程中，大多數的腫瘤細胞受到免疫系統抑制的可能性較大，對免疫反應進行抑制，或逃避免疫監視，在腫瘤病變的發展過程中顯得至關重要[14-21]。
　　本研究結果顯示，crExo樣品電鏡下呈圓形，直徑30～1000 nm。crExo樣品表達外泌體標志物蛋白CD63、CD9，對albumin為輕微表達，對內質網蛋白標志物calnexin則不表達。非小細胞肺癌細胞株的crExoh濃度檢測結果顯示，晚期的濃度較早期顯著升高（P<0.05）。該結果與相關文獻[22-23]報道結果相似，進一步提示，制備并形態觀察Exosomes，鑒定收集的培養非小細胞肺癌的上清中含有源性Exosomes。
　　綜上所述，Exosomes對腫瘤的增殖、侵襲和轉移等生物學行為具有重要的調控作用，非小細胞肺癌發生腦轉移也受Exosomes的影響。
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　?。ㄊ崭迦掌冢?018-08-27 本文編輯：任秀蘭）
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